Base estructural para un amplio desarrollo en el VIH

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2782 (2023) Citar este artículo

917 Accesos

9 Altmetric

Detalles de métricas

La maduración de la afinidad de los anticuerpos permite respuestas inmunes adaptativas a una amplia gama de patógenos. En algunos individuos, se desarrollan anticuerpos ampliamente neutralizantes para reconocer patógenos que mutan rápidamente con una amplia diversidad de secuencias. Por lo tanto, el diseño de vacunas para patógenos como el VIH-1 y la gripe se ha centrado en recapitular el proceso de maduración de la afinidad natural. Aquí, determinamos las estructuras de los anticuerpos en el complejo con la envoltura del VIH-1 para todos los miembros observados y los estados ancestrales del linaje de células B clonales del anticuerpo V3-glicano ampliamente neutralizante del VIH-1 dirigido a DH270. Estas estructuras rastrean el desarrollo de la amplitud de neutralización del ancestro común no mutado y definen la maduración de afinidad a alta resolución espacial. Al dilucidar los contactos mediados por mutaciones clave en diferentes etapas del desarrollo de anticuerpos, identificamos sitios en la interfaz epítopo-paratopo que son el foco de la optimización de la afinidad. Por lo tanto, nuestros resultados identifican cuellos de botella en el camino hacia la maduración de afinidad natural y revelan soluciones para estos que informarán el diseño de inmunógenos destinados a provocar una respuesta inmune ampliamente neutralizante mediante la vacunación.

La maduración de la afinidad de los anticuerpos a partir de los genes de inmunoglobulina (Ig) de cadena pesada y ligera codificados en la línea germinal implica rondas iterativas de hipermutación y selección somática seguidas de expansión y diferenciación de células B, lo que finalmente conduce a la neutralización de patógenos1. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y los métodos para rastrear el desarrollo de anticuerpos ha permitido un seguimiento estrecho del proceso de maduración de la afinidad2,3. Amplios estudios basados ​​en la estructura de anticuerpos solos o de anticuerpos en contacto con antígenos afines han revelado que las ganancias de afinidad implican la adquisición de mutaciones que mejoran los contactos entre anticuerpos y antígenos, la complementariedad de formas, la rigidez del paratopo y la conformación de anticuerpos2,4,5,6,7, 8. La maduración también implica una diversificación independiente de la afinidad que, en conjunto, conduce a una amplia gama de posibles soluciones al problema de optimización de la afinidad4,9. Los anticuerpos con amplitud de neutralización pueden unirse de manera efectiva al antígeno objetivo a pesar de la variabilidad de la secuencia y son un importante objetivo de diseño de vacunas para patógenos como el VIH-1, la influenza y el SARS-CoV-2 y otros coronavirus humanos10,11,12.

Si bien las infecciones por influenza y SARS generalmente se eliminan dentro de un tiempo relativamente corto después de la infección, el VIH-1 es una infección crónica que se integra al genoma y la maduración de anticuerpos que da como resultado anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAbs) solo ocurre durante varios años. Definir vías de maduración de anticuerpos para informar estratégicamente el diseño de inmunógenos y permitir la aceleración de este proceso a través de la vacunación es un objetivo principal de los esfuerzos actuales de vacunas contra el VIH-113. Se han aislado anticuerpos ampliamente neutralizantes de personas que viven con el VIH (PLWH) y proporcionan la base para muchas estrategias de vacunas destinadas a inducir bnAbs14. El desarrollo de bnAb dirigidos por el VIH-1 generalmente requiere un conjunto definido de mutaciones posicionadas específicamente en pares de Ig de cadena pesada/ligera para que ocurran en el clon del anticuerpo, lo que presenta un desafío formidable en el diseño de inmunógenos destinado a recapitular el desarrollo de bnAb. Esto se ve exacerbado por las características poco comunes de los bnAb del VIH-1, que incluyen mutaciones somáticas extensas, regiones determinantes de la tercera complementariedad de cadena pesada larga (HCDR3), inserciones y deleciones de Ig, uso restringido de genes de la línea germinal y enriquecimiento para mutaciones de baja probabilidad15,16,17. Por lo tanto, es esencial una comprensión detallada de los pasos de maduración de la afinidad que conducen al desarrollo de bnAb, incluida la discriminación entre las mutaciones adquiridas que conducen a la respuesta bnAb deseada frente a aquellas que culminan en respuestas fuera del objetivo menos productivas, para identificar los determinantes de la célula B bnAb madurada por afinidad. selección del receptor (BCR).

El estudio de la coevolución de clones de virus y anticuerpos durante la infección por VIH informa el diseño de vacunas al definir las variantes de la envoltura del VIH-1 (Env) que evolucionan durante el desarrollo de bnAb, lo que proporciona un plan para el diseño iterativo de inmunógenos7,18,19,20. Los objetivos de los bnAb del VIH-1 son epítopos conservados en la proteína Env21,22,23,24. El Env del VIH-1 es un trímero de heterodímeros gp120-gp41 que están fuertemente protegidos del sistema inmunitario del huésped mediante la glicosilación ligada a N y más protegidos de la neutralización mediante el enmascaramiento conformacional y una variabilidad de secuencia considerable.

Una región glicosilada cerca de la base del tercer bucle variable (V3) de la Env del VIH-1 forma un supersitio de vulnerabilidad al que se dirigen los anticuerpos que se originan en diversos genes de la línea germinal en múltiples individuos infectados por el VIH-125. Se estudió el desarrollo de un anticuerpo V3-glicano ampliamente neutralizante en un varón africano que vivía con SIDA de Malawi (CH848, clado C), a quien se siguió desde el momento de la infección hasta 5 años después de la transmisión20. En el individuo CH848, la aparición temprana de dos clones autólogos de células B neutralizantes "cooperantes" (DH272 y DH475) condujo a la selección de variantes de escape viral, que a su vez estimuló el clon DH270 que se desarrolló aún más para adquirir una potente amplitud de neutralización20. El linaje DH270 se deriva de los genes de cadena pesada y ligera VH1-2*02 y Vλ2-23, respectivamente, con una longitud de región determinante complementaria de cadena pesada de veinte residuos de aminoácidos20, DH270.6, el miembro del linaje con la mayor amplitud y potencia, neutraliza el cincuenta y uno por ciento de un panel de pseudovirus multiclado con una potencia media geométrica de ~0,21 µg/ml26. Con niveles de mutación somática de 12,8 y 6,7 por ciento para los genes de cadena pesada y ligera, respectivamente, DH270.6 se encuentra entre los V3-glicanos bnAbs26 menos mutados. Los anticuerpos DH270 se detectaron en el individuo CH848 en la semana 186 y coincidieron con la aparición de variantes de Env con un bucle variable acortado 1 (V1)20. El anticuerpo ancestro común no mutado DH270 inferido (DH270.UCA), que representa el progenitor de células B ingenuas del clon DH270, no neutraliza el VIH-1 heterólogo, aunque un solo cambio de aminoácido en la posición 57 de la cadena pesada que sustituyó una glicina por una arginina (G57R) dio como resultado una neutralización heteróloga del VIH-1, aunque con amplitud limitada. A medida que la afinidad del clon DH270 maduró y los anticuerpos acumularon mutaciones en sus regiones variables de cadena ligera y pesada (VH y VL), mejoraron la amplitud y la potencia de la neutralización heteróloga. Los primeros anticuerpos intermedios ancestrales DH270 pudieron neutralizar virus heterólogos con bucles V1 cortos. El linaje clonal de células B DH270 evolucionó para ganar capacidad para neutralizar virus con bucles V1 más largos, aunque con potencia reducida20. Se observó una correlación inversa similar entre la potencia y la longitud de V1 para otros bnAbs de glucano V3 10-1074, PGT121 y PGT12827,28. El rico conjunto de datos de anticuerpos coevolutivos y Envs disponibles para el clon DH27020 presentó una oportunidad para estudiar los aspectos estructurales de la maduración por afinidad y la coevolución del virus a un nivel de detalle sin precedentes y para definir cómo esta información informará el diseño de vacunas destinadas a obtener bnAbs dirigidos a los supersitio V3-glicano.

Tres descubrimientos clave han informado nuestra comprensión actual del clon DH270. Primero, aunque la hipermutación somática es un proceso estocástico, existen puntos calientes y puntos fríos en la secuencia de anticuerpos para mutaciones somáticas mediadas por citidina desaminasa inducida por activación (AID), lo que lleva a diferencias en las probabilidades con las que se mutan los residuos de anticuerpos. Esto, combinado con la posible necesidad de múltiples cambios de base, puede conducir a que ocurran ciertas mutaciones con baja probabilidad, definida aquí como menos del dos por ciento. Los bnAbs del VIH-1, incluidos los del clon DH270, están enriquecidos para mutaciones clave de baja probabilidad17. En segundo lugar, de las cuarenta y dos mutaciones en el miembro más amplio y potente de este clon, solo se necesitan doce para alcanzar el noventa por ciento de su amplitud, lo que nos permite identificar las regiones más críticas del anticuerpo que deben optimizarse29. Finalmente, clave para considerar la maduración de la afinidad en el contexto del desarrollo de vacunas, hemos demostrado que los inmunógenos diseñados racionalmente pueden expandir los precursores de glucano DH270 bnAb V321.

Aquí usamos cryo-EM para visualizar las interacciones de un árbol clonal DH270 inferido completo con el virus Env en evolución conjunta. Definimos las defensas montadas por el virus para proteger su epítopo V3-glicano durante la infección y demostramos cómo el clon DH270 se desarrolló para atacar primero a Env y luego maduró para eludir de manera efectiva estas barreras para lograr la amplitud de neutralización. Nuestros resultados muestran que el desarrollo de clones involucró soluciones secuenciales para ganar afinidad en sitios de contacto antígeno-anticuerpo específicos. En cada etapa de desarrollo, la adquisición de una solución fue seguida por la división del clon en distintos subclones que conducen a ganancias diferenciales en afinidad y amplitud de neutralización. Estos resultados mostraron que las mutaciones adquiridas temprano en el clon determinaron el destino de la maduración de la afinidad clonal DH270 corriente abajo. La maduración de anticuerpos implicó la optimización específica del sitio por etapas de los contactos epítopo-paratopo con el sitio de cambio de foco a medida que las mutaciones evasivas se acumulaban en la superficie antigénica.

Las estructuras de varios fragmentos de unión al antígeno DH270 (Fab) se han determinado previamente, incluidos los UCA DH270 inferidos, así como los anticuerpos maduros DH270.3, DH270.5 y DH270.6 que se aislaron del individuo CH848. Además, se han determinado las estructuras de un fragmento variable monocatenario (scFv) de DH270.1, un DH270.3 asociado a manosa, un scFv de DH270.6 asociado a un péptido de glucano V3 y DH270 UCA y DH270.6 Fabs20 unidos al ectodominio de Env soluble. ,21,30. Si bien la estructura DH270.6 asociada a V3-glicano aclaró el papel de los residuos individuales críticos para la amplitud de neutralización, no reveló la vía estructural subyacente a la evolución de esta amplitud, ni mostró cómo la amplitud y la potencia se vieron afectadas por mutaciones en diferentes clados DH270 y subclades. Por lo tanto, buscamos determinar el impacto de las mutaciones en cada etapa de maduración mediante la determinación de las estructuras crio-EM de los Fab miembros clonales DH270 asociados a Env de VIH-1 de cada intermedio ancestral de anticuerpo y todas las formas de anticuerpos maduros (Fig. 1 y Figs. 1 complementarias). y 2). Se usó un trímero SOSIP soluble derivado de un virus aislado del individuo CH848 el día 949 (denominado aquí d949 Env) después de la transmisión para preparar complejos con Fabs del clon DH270 para estudios estructurales. Este sobre se seleccionó por su proximidad temporal a la aparición del linaje DH270 en el paciente infectado y porque interactúa con todos los miembros del linaje DH270. Con la constante Env, todas las diferencias estructurales observadas pueden atribuirse a diferencias de aminoácidos de anticuerpos. Las resoluciones de mapa variaron de 5,3 a 3,3 Å con resoluciones locales en la interfaz Fab-Env en el rango de 5 a 3 Å (Figuras complementarias 2-4, Tablas 1 y 2).

A (arriba a la izquierda) Un ectodominio de la envoltura del VIH-1 (Env) unido al Fab del anticuerpo DH270 resaltando las subunidades gp120 (azul) y gp41 (naranja). Las cadenas pesadas y ligeras de Fab del anticuerpo están coloreadas en rojo y gris, respectivamente, con los glucanos epítopos representados en la representación de barras. (derecha) Vistas ampliadas, superior y lateral de los contactos paratopo-epítopo. Los círculos discontinuos indican distintas regiones de contacto. (abajo a la izquierda) Los indicadores numéricos identifican los sitios de contacto resaltados por los círculos discontinuos en los paneles de la derecha. B El árbol filogenético del clon DH270 inferido que representa mapas crio-EM determinados para cada miembro clonal Fab unido al trímero CH848 d949 (blanco). Los nombres de los miembros clonales están coloreados según el color Fab de cada mapa. La numeración negra indica las ubicaciones de las mutaciones consecuentes en cada anticuerpo de acuerdo con los sitios enumerados en A. Las afinidades por los anticuerpos en el camino que conduce a la forma madura más amplia y potente, M6, se indican en rosa. Los miembros clonales intermedios se indican con una I, mientras que los anticuerpos maduros se indican con una M.

El mapeo de las mutaciones del clon DH270 en las estructuras crio-EM reveló sitios agrupados que mutan secuencialmente a lo largo del árbol clonal de células B (Fig. 1A). Estos grupos asignados a siete sitios distintos de contacto anticuerpo/Env: (1) interacción del brazo D1 distal del Env N332-glicano con la hendidura formada entre los segmentos de cadena ligera y pesada variable Fab (VH/VL) que involucran la cadena ligera- región determinante de complementariedad de cadena dos (LCDR2) y región determinante de complementariedad de cadena pesada tres (HCDR3), (2) interacción de la base N332-glicano GlcNac con la región del anticuerpo HCDR3, (3) contacto del bucle Env V1 y del motivo GDIR/K conservado en el bucle V3 con las regiones Fab HCDR3 y HCDR2, (4) interacción de los brazos D del Env N156-glicano con la región marco del anticuerpo, (5) interacción de la base de Env N301-glicano GlcNac- 1 y residuos alrededor del motivo V3 GDIR/K con la región Fab LCDR3, (6) contacto del punto de ramificación de Env N301-glicano y brazos D con el sitio N-terminal Fab LCDR1/VL, y (7) contacto de Env N442-glicano con región Fab LCDR1 (Fig. 1A). Juntos, estos comprenden la totalidad de la superficie interactiva disponible para los anticuerpos del clon DH270.

Las reconstrucciones crio-EM se resolvieron en las interfaces Ab/Env para permitir la construcción de modelos atómicos. No observamos ningún patrón claro de mejora en las resoluciones de la interfaz con mayor fuerza de interacción. Esto podría deberse a la variabilidad en los conjuntos de datos crio-EM, así como a las reducciones en la estabilidad térmica en el linaje DH270 durante la maduración por afinidad6.

Surgieron patrones claros de mutaciones a lo largo del árbol clonal DH270 en los sitios interactivos de Env descritos anteriormente que sugerían que el clon DH270 evolucionaba para resolver cuellos de botella estructurales secuenciales específicos en el camino de la maduración por afinidad (Fig. 1B). El primer intermedio, I5, adquirió mutaciones que fortalecieron las interacciones en los grupos 3 y 6 al mejorar los contactos proteína-proteína, así como las interacciones del anticuerpo con el glicano N301, lo que resultó en una afinidad de unión mejorada ~ 8 veces al d949 Env en relación con la UCA. Después del intermedio I5, el clon se divide en dos caminos distintos a lo largo de un clado definido por el intermedio I3 y un clado definido por el intermedio I4. Esta división consecuente conduce a la adquisición de una mayor potencia y amplitud de neutralización en el clado I3, lo que conduce al DH270.6 bnAb (Fig. 1B)20. Ambos clados adquirieron mutaciones alrededor del sitio de interacción N332-glicano pero en posiciones diferentes. El intermedio I3 mejora la interacción con el brazo distal N332-glicano D1 (grupo 1) mientras que el intermedio I4 mejora la interacción con la base N332-glicano GlcNac (grupo 2). Cada intermedio luego se divide en dos subclades, revelando un objetivo Env conservado para la optimización del contacto por parte de tres de los cuatro anticuerpos maduros/intermedios. Estos incluyen el anticuerpo maduro del clado I4 DH270.3, el anticuerpo maduro del clado I3 DH270.1 y el anticuerpo intermedio I2, que muestran varias mutaciones agrupadas en o adyacentes a la región del anticuerpo LCDR3, lo que presumiblemente mejora las interacciones con la base de glicano Env N301 ( grupo 5). El anticuerpo maduro del clado I4 DH270.2 adquirió mutaciones centradas en el grupo 1, mejorando las interacciones en el brazo N332-glucano D1 de manera similar al intermedio I3. El intermediario I2 adquirió mutaciones adicionales en los grupos 3, 4 y 7, con DH270.6 maduro, el anticuerpo más amplio y potente del clon, modificando aún más las interacciones en el grupo 7. Se diseñó un anticuerpo DH270 mínimamente mutado (minDH270)29 donde solo Se necesitaron 12 de las 42 mutaciones en DH270.6 para alcanzar ~90 % de la amplitud y potencia de DH270.6. Es importante destacar que las mutaciones incluyeron solo aquellas que aparecieron en I5, I3 e I2. De acuerdo con esta observación, las mutaciones posteriores a I2 ocurrieron en sitios más distales y sus efectos fueron menos claros en comparación con las mutaciones que aparecieron en los miembros anteriores del clon DH270, como se describe a continuación. Los anticuerpos DH270.5 y DH270.6 adquirieron varias mutaciones cerca del terminal LCDR1/VL N donde pueden ocurrir interacciones con los brazos N301-glicano D. Las reconstrucciones crio-EM en esta región se resolvieron de manera deficiente, lo que impide una definición precisa de estas interacciones. Juntos, estos resultados indican que la maduración del clon DH270 implicaba una ganancia de afinidad secuencial en sitios distintos, y que eran necesarias soluciones estructurales específicas para la ganancia de afinidad y el desarrollo de la amplitud de neutralización. Esto se ejemplifica en la dicotomía donde la adquisición de mutaciones en la región del anticuerpo LCDR3 condujo a una ganancia de amplitud de neutralización en DH270.1 y en el intermedio I2, pero a una pérdida de amplitud de neutralización en DH270.3.

A continuación, estudiamos los arreglos estructurales específicos que subyacen a la maduración en cada etapa, examinando primero las mutaciones en el intermedio I5 (Fig. 2A, B). Previamente determinamos las estructuras para el DH270 UCA y los Fab DH270.6 maduros unidos al trímero CH848 d949 Env con los glucanos del bucle V1 en las posiciones 133 y 138 eliminados21. En la estructura unida a UCA, el bucle V1 interactúa con el anticuerpo, el motivo V3 GDIK y los residuos V3 adyacentes, mientras que en la Env unida a DH270.6, el bucle V1 se desplazó de esta posición de modo que ya no interactúa con el V3 GDIK. motivo. Este desplazamiento se atribuyó a la mutación VH G57R que ocurre en el primer intermedio21. Para visualizar la conformación del bucle V1 cuando no está unido a un anticuerpo en el epítopo de bNAb de glicano V3, determinamos la estructura del d949 SOSIP Env en complejo con el anticuerpo VRC01 del sitio de unión de CD4. Descubrimos que la conformación del bucle V1 no unido se parecía a la del bucle V1 unido a UCA (Fig. 6A complementaria). Determinamos además la estructura de DH270.UCA que incorpora la mutación VH G57R en complejo con CH848 d949 SOSIP Env (Fig. 2C y Fig. 6B complementaria). El bucle V1 en la estructura UCA + G57R se desplazó de su posición observada en sus formas libres y unidas a UCA donde interactuó y protegió el motivo V3 GDIK (Fig. 6C complementaria). El desplazamiento del bucle V1 en la estructura UCA+G57R se acompaña de un marcado cambio en la orientación del anticuerpo, rotando el Fab VH/VL hacia el espacio previamente ocupado por el bucle V1, acercando el anticuerpo al Env (Fig. 2C y Fig. 6D complementaria). La comparación de la estructura del complejo unido a UCA+G57R con el complejo unido a I5 reveló cambios adicionales en la orientación del anticuerpo orquestados por las otras mutaciones adquiridas en el intermediario I5. La sustitución VL S27Y cerca del punto de ramificación de β-manosa del glicano N301 es el culpable probable, alterando la orientación del glicano N301 en el complejo unido a I5 en relación con el complejo unido a UCA+G57R (Fig. 2D).

Un árbol clonal DH270 que destaca los anticuerpos intermedios UCA e I5. B Vistas superior y lateral del sitio de contacto I5. Los carbonos alfa (Cα) de mutación de cadena pesada y ligera se presentan como esferas. C Vista superior de los contactos de la cadena pesada UCA y UCA+G57R con gp120 que resaltan los cambios en la posición del anticuerpo y en el bucle Env gp120 V1. La representación de dibujos animados discontinuos para el Env V1 unido a UCA-G57R conecta los residuos 133 y 153 entre los cuales la densidad del mapa para V1 es débil. D Mapa filtrado gaussiano del complejo de trímero unido a Fab UCA+G57R (gris) superpuesto con un mapa filtrado y sustraído del complejo de trímero unido a Fab I5 (verde). La ubicación de la mutación S27Y en los mapas se indica en naranja. E (arriba a la izquierda) Ángulo de contacto theta y diedro phi con posiciones de los centroides utilizados para los cálculos indicados con esferas. (centro a la izquierda) Alineación (solo gp120) de estructuras de estado ligado UCA y UCA+G57R que resaltan el cambio en la disposición de anticuerpos sobre el ángulo theta. (abajo a la izquierda) Alineación (solo gp120) de estructuras de estado unido UCA+G57R e I5 que resaltan el cambio en la disposición de anticuerpos sobre el diedro phi. (arriba a la derecha) Distancia del centroide Fab VH/VL del anticuerpo desde el centroide del epítopo gp120. (abajo a la derecha) Gráfico theta vs. phi para las estructuras UCA, UCA+G57R e I5. Los colores de los puntos de datos coinciden con los colores de las cadenas pesadas respectivas en las estructuras.

A continuación, cuantificamos estos cambios en la orientación del anticuerpo usando ángulos basados ​​en vectores entre el anticuerpo Fv y su epítopo gp120. Se usaron centroides para el epítopo, el Fv y un punto de anclaje en el VH para determinar la distancia entre el Fv y su epítopo y el ángulo (theta), con un punto de anclaje adicional en el epítopo agregado para examinar la rotación (phi) del anticuerpo en relación con el epítopo (Fig. 2E). Theta y phi describen el ángulo de enfoque del anticuerpo con referencia al epítopo, lo que permite una inspección minuciosa de las diferencias en la disposición del anticuerpo a medida que se acumulan las mutaciones en el clon. La distancia entre el anticuerpo y el epítopo se redujo ~0,5 Å en la estructura unida a UCA+G57R en relación con la estructura unida a UCA, y se observaron reducciones menores adicionales en I5 asociadas con las mutaciones adicionales de I5 (Fig. 2E). La comparación de las disposiciones de ángulo y diedro de las estructuras UCA y UCA+G57R mostró una rotación en cada una de ~2°. El intermedio I5 mostró una mayor rotación sobre el diedro phi en la dirección de la mutación S27Y sin cambios adicionales en el ángulo de rotación theta. Juntos, estos resultados demuestran que las mutaciones tempranas en el clon DH270 facilitan contactos mejorados, cambian la posición del anticuerpo en relación con el Env unido y alteran la conformación de Env, particularmente del bucle V1 y el glicano N301, con los cambios angulares y conformacionales fortaleciéndose aún más. interacciones anticuerpo-Env.

A continuación, examinamos el desarrollo temprano de dos clados distintos en el clon DH270 del intermedio I5 (Fig. 3A, B). El intermedio I3 que se produce después de I5 en el clon DH270.6 incorpora mutaciones de cadena pesada V11M, R87T y la improbable mutación R98T, y mutaciones de cadena ligera L48Y y S54N. La reconstrucción crio-EM del Env unido a Fab I3 se determinó a una resolución de 4,5 Å. El cambio conformacional del bucle V1 inducido por el residuo VH R57 se retuvo, al igual que la interacción del residuo VL Y27 con el glucano N301 (Fig. 3B y Fig. 7A, B complementarias). No se observaron diferencias importantes en las subunidades gp120 y gp41 de la estructura Env unida a Fab I5 e I3 (RMSD ~ 0.9 Å; Fig. 7C complementaria). Como se describió anteriormente30, las mutaciones VL L48Y y VH R98T introducen nuevos contactos de enlaces de hidrógeno, con el hidroxilo Y48 interactuando con el N332-glicano, y la liberación de D115 a través de la mutación R98T aumentando el número de interacciones de enlaces de hidrógeno D115 con el N332-glicano (Fig. 3C y Fig. 7D complementaria). Además, la sustitución I3 VH R98T introdujo un enlace de hidrógeno entre las cadenas laterales de los residuos T98 y VH Y27 (Fig. 7E complementaria), lo que reforzó la estabilidad interna de la estructura del anticuerpo al compensar la pérdida de la interacción catión-π de R98. con Y27. Las mutaciones VH R87T y VL S54N están distantes de la región interactiva con gp120 del anticuerpo. Un examen minucioso de las regiones locales de estas mutaciones sugirió funciones potenciales de estas sustituciones en el aumento de la estabilidad interna del anticuerpo. La sustitución VH R87T alivia la tensión electrostática aportada por tres argininas agrupadas espacialmente, R67, R85 y R87 (Fig. 3D y Fig. 7F complementaria). En particular, una segunda arginina en este grupo, R85, se muta a serina en el siguiente paso cuando I3 pasa a I2. Además, la cadena lateral T87 forma un enlace de hidrógeno con el nitrógeno de la cadena principal del residuo VH D89, aumentando así la estabilidad de la estructura local. El efecto de VL S54N fue más sutil con N54 que parecía estabilizar la interacción con una cadena beta adyacente a través de enlaces de hidrógeno de su cadena lateral con la cadena principal del residuo de cadena ligera 66 (Fig. 7G complementaria).

Un árbol clonal DH270 que destaca los anticuerpos intermedios I5, I3 e I4. B Vistas superiores de los sitios de contacto I3 e I4. Los carbonos alfa (Cα) de mutaciones de cadena pesada y ligera se presentan como esferas. C (izquierda) El contacto del brazo N332-glicano D1 con la hendidura I5 VH/VL. (derecha) El contacto del brazo N332-glicano D1 con la hendidura I3 VH/VL. D Estructura del intermedio I3 en el sitio R87T cerca de contactos potenciales de N156-glucano. E Dominios VH I5 e I3 alineados que resaltan el cambio en el ángulo del codo (magenta). F (izquierda) Mapee y ajuste las coordenadas del nuevo contacto N332-glicano formado en el sitio de mutación I4 HCDR3 S108Y. (derecha) Dominios VH I5 e I4 alineados que muestran arreglos de bucle HCDR3.

Las estructuras de los anticuerpos I5 e I4 eran similares y, como predijeron las simulaciones previas de dinámica molecular6, la mutación V11M en I3 indujo un marcado cambio en la bisagra del codo Fab del anticuerpo (Fig. 3E). A diferencia de I3, el intermedio I4 no adquirió una mutación del codo y, en consecuencia, no mostró un cambio distinto en la región del codo (Fig. 7H complementaria). Al igual que en I3, el residuo R57 en I4 mostró evidencia de cambio de posición del bucle V1 (Fig. 7I complementaria). Sin embargo, se observó una densidad adicional en esta región que es consistente con un bucle V1 acoplado a GDIK, lo que sugiere un comportamiento multiestado. El intermedio I4 adquirió una mayor cantidad de mutaciones VH, incluidas dos en HCDR3, Y106V y S108Y que esencialmente cambian la posición de la tirosina del residuo 106 al 108. El grupo hidroxilo en I4 Y108 formó un enlace de hidrógeno con el N332 GlcNac-2 (Fig. 3F izquierda). La conformación del esqueleto de HCDR3 no se vio alterada por estas mutaciones (Fig. 3F derecha). La mutación I4 S84R está cerca de las unidades de azúcar distales N156-glicano. Sin embargo, las densidades de la cadena lateral y esta porción del glucano N156 no fueron visibles en la reconstrucción crio-EM (Fig. 7J, K complementarias). Las mutaciones restantes en la cadena pesada I4 en las posiciones G49A, N54T, Q62R e Y116S no desempeñan un papel claramente descifrable en la interacción con Env o en la modificación de la estructura del anticuerpo. La cadena ligera contiene dos mutaciones no paratópicas, R56W y V100I. No se observaron cambios alrededor de la posición V100I con respecto a I5 o I3. El residuo R59W de la cadena ligera I4 que está adyacente a la región LCDR2 mostró un reordenamiento modesto que cambia la posición de los residuos interactivos de N332-glicano distales (Figura 7L complementaria). Esto no se asoció con cambios aparentes en las interacciones de los anticuerpos con el glucano, aunque puede conferir la estabilización del bucle LCDR2 y, por lo tanto, la interacción con el glucano. Estas observaciones muestran que en esta etapa de desarrollo, las interacciones con el glicano N332 fueron el foco de optimización en ambos clados del árbol clonal DH270.

El clado I4 conduce a los anticuerpos maduros DH270.2 y DH270.3 (Fig. 4A, B). DH270.2 mostró mayor amplitud y potencia que DH270.3 con cada neutralización de diez y quince miembros de un panel heterólogo de 24 virus, respectivamente, aunque ambos mostraron una amplitud y potencia de neutralización más débiles en comparación con los anticuerpos maduros del clado I3 que neutralizan entre dieciséis y diecisiete miembros del panel heterólogo21. La alineación de las estructuras unidas a Env reveló distintos cambios en la orientación de cada anticuerpo en comparación con el intermedio I4 (Fig. 4C y Fig. 8A complementaria). La inspección de los ángulos theta y phi indicó que DH270.3 había cambiado predominantemente su rotación alrededor del epítopo (Fig. 4D). La mutación más notable en DH270.3 fue la reversión de la cadena ligera Y27S. Se observó un cambio claro en la posición del glucano N301 en relación con el intermedio I4 (Fig. 4E y Fig. 8B complementaria). De acuerdo con la rotación observada del anticuerpo unido en el complejo I5/Env en relación con el complejo UCA+G57R/Env, la reversión de Y27S dio como resultado que DH270.3 ocupara una orientación coincidente con UCA+G57R (Fig. 4F). Esta reversión de la orientación del anticuerpo sugiere que la sustitución S27Y, adquirida por primera vez en I5, es el impulsor de la rotación del anticuerpo y la reorientación de N301-glucano que se observó al pasar de UCA a I5.

Un árbol clonal DH270 que destaca los anticuerpos intermedios I3 e I2 y el anticuerpo maduro DH270.1 (M1). B Vistas superiores de los sitios de contacto I2 y DH270.1. Los carbonos alfa (Cα) de mutaciones de cadena pesada y ligera se presentan como esferas. C Alineación (solo gp120) de las estructuras de estado ligado I3 e I2 que destaca el cambio en la disposición del bucle gp120 V1 y el contacto entre la cadena lateral I2 R84 y el glucano N137. D Alineación (solo gp120) de estructuras unidas a UCA e I2 que resaltan la similitud conformacional entre los bucles gp120 V1. E (derecha) Distancia del centroide Fab VH/VL del anticuerpo desde el centroide del epítopo gp120. (izquierda) Gráfica theta vs. phi para las estructuras I3, I2 y DH270.1. Los colores de los puntos de datos coinciden con los colores de las cadenas pesadas respectivas en las estructuras. F Comparación de la vista lateral del contacto del epítopo de la región LCDR3 entre I3 e I2 que resalta el cambio en la conformación LCDR3 (flecha magenta). G Comparación de la vista superior del contacto del epítopo de la región LCDR3 entre I3 e I2 que destaca el cambio en el rotámero del residuo aromático 93 (flecha magenta). H Alineación (solo gp120) de las estructuras de estado enlazado I3 y DH270.1 con el mapa DH270.1 que resalta la mutación Y106S.

Se produce un grupo de mutaciones, incluida una improbable mutación VH G110Y, en y alrededor de DH270.3 LCDR3, cerca del contacto entre un bucle adyacente al motivo V3 GDIK y la base N301-glicano GlcNac. Mutaciones adicionales, F93S, A94T, G95N y S97A, dan como resultado la remodelación de la interacción N301-glicano, cambiando la posición de la cadena lateral LCDR1 Y32 para la interacción con el primer N301-GlcNac y la interacción de N95 con el segundo N301-GlcNac ( figura 4G). Además del cambio angular y las mutaciones relacionadas con LCDR3, una mutación G103S en HCDR3 agrega un enlace de hidrógeno con el resto N-acetilo N332-glicano GlcNac-2 (Fig. 8C complementaria). Mientras que las mutaciones DH270.3 optimizaron las interacciones con el glicano N301, las mutaciones DH270.2 se centraron en cambio en la interacción N332-glicano del brazo D1. De las tres mutaciones de cadena pesada R98K, W101Y y D115N, la mutación D115N mostró el cambio más claro en la interacción. La pérdida de la carga negativa en D115N permitió que la cadena lateral de la asparagina se alejara del K98 con carga positiva en ~1.6 Å (D y N Cγ a R Nε o K Cε) para formar una extensa red de enlaces de hidrógeno con el brazo D1 de N332-glicano (Figura 4H). Esto reflejó la mutación R98T en I3, donde D115 se liberó de su interacción con el residuo R98 de VH cargado positivamente para unirse al glucano N332. Juntos, el análisis de las estructuras DH270.2 y DH270.3 unidas a Env sugiere que cada uno siguió diferentes caminos de desarrollo y cada uno se dirigió a sitios distintos. La mayor amplitud del anticuerpo DH270.2 en comparación con DH270.3 es probablemente un efecto combinado de mejora en la interacción N332-glucano en DH270.2 y la reversión Y27S en DH270.3.

La siguiente etapa de desarrollo en el clado I3 del clon DH270 condujo a las ganancias más sustanciales en la afinidad de unión a Env (Fig. 1B) y la amplitud de neutralización del VIH-120. El intermedio I3 se divide en el intermedio I2 y el anticuerpo DH270.1 maduro, los cuales adquieren mutaciones que se centran principalmente en la región LCDR3 (Fig. 5A, B). Una característica notable en la reconstrucción crio-EM del complejo I2-Env es el bucle V1 bien resuelto con una configuración alterada. También se observó una densidad bien resuelta para el glucano N137 del bucle V1, que se puso en contacto con el sitio de mutación S84R de la cadena pesada I2 (Fig. 5C y Fig. 9A complementaria). Esta mutación también ocurrió en el intermedio I4 que mostró densidades similares, aunque menos claras, para un bucle V1 que estaba acoplado con el motivo V3 GDIK. La reorientación del bucle V1 desplazó R57 hacia el motivo V3 GDIK, lo que resultó en su interacción con D325 (Fig. 9B complementaria). Esta orientación del bucle V1 era similar a la estructura del trímero unido a UCA con una torcedura en el bucle introducida para acomodar R57 (Fig. 5D). La cuantificación de la orientación del anticuerpo mostró una rotación de I2 VH/VL alejándose del bucle V1 para adaptarse a este reordenamiento del bucle (Fig. 5E).

Un árbol clonal de DH270 que destaca el anticuerpo intermedio I4 y los anticuerpos maduros DH270.2 (M2) y DH270.3 (M3). B Vistas superiores de los sitios de contacto DH270.2 y DH270.3. Los carbonos alfa (Cα) de mutaciones de cadena pesada y ligera se presentan como esferas. C (izquierda) Alineación (solo gp120) de estructuras de estado ligado I4 y DH270.2 que resaltan el cambio en la disposición de anticuerpos (derecha) Alineación (solo gp120) de estructuras de estado ligado I4 y DH270.3 que resaltan el cambio en la disposición de anticuerpos. D Gráfica de Theta frente a phi para las estructuras I4, DH270.2 y DH270.3. Los colores de los puntos de datos coinciden con los colores de las cadenas pesadas respectivas en las estructuras. E Estructura superpuesta de los glicanos I4 y DH270.3 N301 que muestra su cambio en la disposición y la ubicación de los residuos S27 o Y27 en la cadena ligera del anticuerpo. F Alineación (solo gp120) de estructuras de estado ligado UCA+G57R y DH270.3 que indican arreglos de estado ligado similares. G Comparación del sitio de contacto LCDR3 con la proteína gp120 y el glucano N301 entre las estructuras I4 (superior) y DH270.3 (inferior). H Comparación de los contactos del anticuerpo del brazo N332-glicano D1 entre las estructuras I4 (superior) y DH270.2 (inferior).

El intermedio I2 y DH270.1 adquieren varias mutaciones modificadoras de LCDR3 como las observadas en DH270.3 (Fig. 5F, G y Fig. 9C, D suplementarias). En DH270.1 ocurrieron varias mutaciones en la base de LCDR3 que estaban distales al epítopo y, juntas, probablemente estabilizaron la región de LCDR3 (Fig. 9E, F complementarias). Se producen mutaciones similares en el intermedio I2, sobre todo una mutación F101C espacialmente adyacente a la base LCDR3 que da como resultado la formación de un enlace disulfuro adicional en el anticuerpo entre los residuos 91 y 101 (Fig. 9D complementaria). Esta mutación se encuentra entre el conjunto mínimo de mutaciones descritas anteriormente necesarias para alcanzar ~90 % de la amplitud de DH270.629. Un número considerable de mutaciones en y que afectan a LCDR3 también formaron parte de la construcción minDH270 y tienen efectos distintos en la interacción del epítopo en la estructura de unión intermedia I2. Estos incluyeron el VL Y93F, A94G y S97A que funcionan en conjunto con VH G110Y para provocar un reordenamiento en la región LCDR3, creando un bolsillo en el que descansa el resto N-acetilo N301 GlcNac-1 (Fig. 5F). Un impacto importante de la improbable mutación HCDR3 G110Y en la creación de este bolsillo es el desplazamiento del rotámero F93 a través de la oclusión estérica (Fig. 5G). Además, se produce una mutación HCDR3 Y106S en DH270.1 que resultó en dos efectos. Primero, la pérdida de un enlace de hidrógeno entre la cadena lateral de Y106 con la cadena principal de W101 y, segundo, la liberación de la interacción de la cadena lateral de Y106 con el glicano N332; juntos, estos pueden actuar para modular la interacción del glucano N332 con HCDR3 al permitir que se una a la cadena lateral W101 de manera más efectiva (Fig. 5H). Estos resultados, junto con los cambios LCDR3 observados en DH270.3, sugieren que las modificaciones de la interacción en este sitio fueron esenciales para la maduración de la afinidad.

Desde el intermedio I2, el clon se divide en dos caminos, ambos culminando en una amplitud de neutralización similar, aunque el DH270.6 tiene la mayor potencia (Fig. 6A, B)20. El camino superior desde I2 conduce al intermedio I1 y luego a los anticuerpos maduros DH270.4 y DH270.5. Las mutaciones en este subclade I1 generalmente estaban más alejadas de la superficie interactiva anticuerpo-antígeno con impactos estructurales menos claros. En I1, dos mutaciones con posibles impactos en el bucle LCDR2, N62H y R65W, podrían afectar las interacciones del brazo N332-glicano D1 (Fig. 6C y Fig. 10A complementaria). Sin embargo, este ciclo se resolvió mal, lo que limita nuestra capacidad para determinar qué impacto tienen estas mutaciones, si es que tienen alguno. En DH270.4, una mutación VH S85R está posicionada para la interacción con el glicano N156 (Fig. 6D y Fig. 10B complementaria). Sin embargo, como fue el caso de las mutaciones intermedias de I1, esta región está mal resuelta y, por lo tanto, la interacción no puede confirmarse. Aunque el brazo N301-glicano D no estaba bien definido en densidad, el VH y VL de DH270.5 y DH270.6 adquirieron varias mutaciones en la proximidad del brazo N301-glicano D (Fig. 6E, F y Fig. 10C, D). Las densidades consistentes con los estados de bucle V1 acoplado y desacoplado de V3 GDIK fueron evidentes en el trímero enlazado DH270.6 (Fig. 6H y Fig. 10E, F complementaria). Se produjeron mutaciones adicionales en DH270.6 cerca del N442-glicano y la configuración del bucle V1 que se desplazó del motivo V3 GDIK (Fig. 6G, H). El examen de estas estructuras indica que las mutaciones después de I2 ocurrieron principalmente en regiones más distales al epítopo, de acuerdo con la capacidad de I2 para neutralizar la mayoría de los virus neutralizados por DH270.6.

Un árbol clonal de DH270 que destaca los anticuerpos intermedios I2 e I1 y los anticuerpos maduros DH270.4 (M4), DH270.5 (M5) y DH270.6 (M6). B Vistas superiores de los sitios de contacto I1, DH270.4, DH270.5 y DH270.6. Los carbonos alfa (Cα) de mutaciones de cadena pesada y ligera se presentan como esferas. C Estructura de los contactos I1 VH/VL con el brazo N332-glicano D1 que muestra las posiciones de las mutaciones VL N62H y R56W. D Estructura de la cadena pesada DH270.4 que muestra la posición de posible contacto entre la mutación S85F y el glucano N156. E Estructura de las mutaciones DH270.5 VH/VL próximas al N301-glicano. F Estructura de las mutaciones DH270.6 VH/VL próximas al N301-glicano. G Estructura de las mutaciones DH270.6 VL próximas al N442-glicano. H La estructura del DH270.6 VH muestra dos estados diferentes del bucle gp120 V1.

En conjunto, la determinación estructural de todo el clon DH270 reveló un proceso intrincado a través del cual se desarrolló la amplitud de neutralización del VIH-1 en el clon DH270 dirigido por el supersitio V3-glucano, con mutaciones tempranas improbables G57R y S27Y del intermedio I5 que alteran la orientación del anticuerpo y confieren una neutralización heteróloga amplitud. El desarrollo de dos clados distintos de I5 a los intermedios I3 e I4 dio como resultado que ambos adquirieran mejoras en la interacción N332-glucano, lo que destaca aún más la importancia del compromiso de N332-glucano para el clon DH270. Cada uno, sin embargo, apuntó a sitios distintos del glicano, con I3 estabilizando el brazo D1 distal e I4 estabilizando la base GlcNac. La maduración aguas abajo de I4 a DH270.2 sugiere que esta no era una solución ideal para adquirir la interacción N332-glicano, ya que DH270.2 adquiere mutaciones como las de I3 para el brazo N332-glicano D1. Post-I3, que conduce a I2 y DH270.1 junto con DH270.3, todos muestran un número considerable de mutaciones en LDCR3 y residuos adyacentes. Si bien DH270.3 adquiere varias mutaciones críticas para la neutralización, incluidas G110Y y S94A, la selección de la reversión Y27S puede haber limitado su amplitud. Donde DH270.1 adquirió mutaciones estabilizadoras de LCDR3, I2, que desarrolló una considerable amplitud de neutralización, modificó la conformación de LCDR3, estabilizando un punto de contacto de base N301-glicano. Esto estuvo mediado por al menos cinco residuos, cada uno de los cuales por sí solo puede haber proporcionado una ganancia de afinidad limitada. En el caso de DH270.3, si primero hubiera estabilizado el brazo N332-glicano D1, las ganancias limitadas asociadas con la optimización del sitio LCDR3 podrían haber sido tratables. Las modificaciones del paratopo aguas abajo del intermedio I2 estaban distantes del epítopo primario y probablemente actuaron para ajustar la afinidad, la amplitud y la potencia. El anticuerpo minDH27029 solo requería mutaciones de I5 a I2, de acuerdo con esta observación. Estos resultados muestran que la selección durante la maduración por afinidad se puede reducir a una serie de cuellos de botella estructurales con el clon de anticuerpo en desarrollo demostrando soluciones óptimas y subóptimas a medida que el clon se divide en distintos caminos.

La evolución de la amplitud de neutralización del VIH-1 en el clon DH270 se produjo en el contexto de la coevolución con el virus, con cambios clave en la maduración de anticuerpos que impulsan la proteína Env y viceversa20. Primero examinamos cómo evolucionó el epítopo DH270 durante la infección en el individuo infectado con VIH-1 CH848 (Figura 11 complementaria). Los primeros anticuerpos del clon DH270 aparecieron entre 793 y 1304 días después de la infección, coincidiendo con una reducción en la longitud del bucle Env V1 de 18 a 19 aminoácidos y una sustitución G300N en Env en una ubicación próxima al epítopo DH270 que apareció el día 699 después. -infección (Fig. 7A). Los primeros intermedios I5 e I3 reconocen solo los Env que albergan estos bucles V1 más cortos y la mutación G300N. De acuerdo con la selección de Env impulsada por los anticuerpos I5 e I3 del clon DH270 anterior (Fig. 12A complementaria), los virus autólogos con bucles V1 más largos y G300 resurgen 1304-1431 días después de la infección. La capacidad del clon DH270 para neutralizar virus con longitudes de bucle V1 más largas y G300 aparece en el intermedio I2 (Fig. 7A, Fig. 12 complementaria). El reconocimiento de bucles V1 más largos y mutaciones del residuo 300 en cuasiespecie CH848 también se refleja en el reconocimiento de anticuerpos DH270 de virus heterólogos con estas características, lo que contribuye a la mayor amplitud de I2 y DH270.6 en comparación con I5 e I320.

Una línea de tiempo de la coevolución de anticuerpos y Env. Los recuadros superiores indican si los Env en cada momento son sensibles (verde) o resistentes a los intermedios tempranos (superior) y a los intermedios posteriores/miembros clonales maduros (inferior). Los períodos de infección en los que dominan los bucles V1 largos se muestran en gris y los puntos de tiempo de mutación clave se resaltan a lo largo del eje de la línea de tiempo. Se determinaron las estructuras de Env para las secuencias aisladas en los días 358, 526, 836 y 949 después de la infección resaltadas en el eje de la línea de tiempo con el período en el que apareció resaltado el clon D270. B (izquierda) Vista lateral de un solo protómero gp120/gp41 que resalta el motivo V1 y V3 GDIR/K. (derecha) Estructuras de bucle V1 de cada aislamiento de Env. C (izquierda) Vista superior de un solo protómero gp120/gp41 que resalta el motivo V1 y V3 GDIR/K. Los mapas y la estructura se ajustan a las estructuras d358 sin ligar (centro a la izquierda), d949 sin ligar (centro a la derecha) y d949 unida a I3 (derecha). D Las estructuras enlazadas I3 (izquierda) e I2 (derecha) que muestran similitud en la conformación del epítopo. E La estructura d526 unida a DH270.6 (izquierda) y la estructura d949 unida a DH270.6 (derecha) muestran similitud en la conformación del epítopo.

Con base en estas dos características de resistencia intermedia temprana, seleccionamos Envs de los días 358 y 526, que tenían G300 y bucles V1 hipervariables largos de 18 y 28 aminoácidos, respectivamente, y Envs de los días 836 y 949, que tenían tanto N300 como V1 hipervariable corto. bucles de 11 aminoácidos, para identificar obstáculos estructurales a la interacción del anticuerpo DH270. Primero examinamos la unión de los anticuerpos del clon a cada ectodominio Env SOSIP mediante ELISA (Figura 13 complementaria). De acuerdo con las observaciones previas, el UCA mostró solo unión a la construcción d949 con I5 uniéndose a las construcciones d949 y d836. Mientras que I3 mostró unión a la construcción d358, I4 no lo hizo. De acuerdo con las diferencias en la maduración temprana de estos clones, los anticuerpos maduros DH270.2 y DH270.3 se unieron más débilmente a la construcción d358 en comparación con I2, I1 y DH270.4-6. Ni DH270.2 ni DH270.3 se unieron a la construcción d526 mientras que se observó una unión medible a I2, I1 y DH270.4-6, aunque la interacción fue más débil que con las otras tres construcciones. A pesar de la pobre similitud de secuencia, el examen de las regiones del bucle V1 de cada estructura de Env sin ligando demostró un núcleo hidrofóbico estructuralmente conservado y un enlace de hidrógeno variable y/o formación de puente salino que asegura el acoplamiento del bucle V1 al motivo V3 GDIR/K. El d358 Env V1 mostró un desorden considerable en una parte del bucle con interacciones hidrofóbicas y de puente salino que lo flanqueaban, lo que aseguró que el bucle permaneciera cerrado sobre el motivo V3 GDIR/K (Fig. 7B y Fig. 14A complementaria). El d526 Env contenía un núcleo hidrofóbico similar y mostraba más orden a pesar de su mayor longitud. Esto se debió a la interacción directa del bucle V1 con el glicano N332 cercano (Fig. 7B y Fig. 14B complementaria). El d836 y d949 Env V1 eran notablemente más cortos, pero aún conservan el núcleo hidrofóbico y la posición acoplada al motivo V3 GDIR/K de los virus anteriores (Fig. 7B y Fig. 15 complementaria). El bucle d836 mostró una torcedura en el bucle cerca del motivo V3 GDIR/K que condujo a una exposición algo mayor del motivo (Fig. 7B y Fig. 15C suplementaria). Juntos, estos resultados indican un papel compartido de V1 para proteger el motivo V3 GDIR/K sensible a la neutralización que está mediado por un núcleo hidrofóbico conservado.

A continuación, examinamos el efecto sobre el epítopo DH270 de la sustitución Env G300N que está asociada con la iniciación del clon. El motivo V3 GDIR/K está próximo a la posición 300, formando una estructura secundaria de hoja beta rota emparejada. La inspección visual del motivo V3 GDIR/K en los mapas Env d358 y d526 que contienen G300 sugirió un mayor desorden en la estructura de la hoja rota en comparación con los mapas Env d836 y d949 que contienen N300 (Fig. 7C). N300 formó un contacto de enlace de hidrógeno con la columna vertebral I326 del motivo V3 GDIK en el estado no unido. Esta interacción se retiene en las estructuras de estado ligado para los intermedios tempranos con pocos cambios en la conformación del motivo V3 GDIK (Fig. 7C). Estos resultados sugieren que el G300N estabilizó el epítopo DH270 permitiendo que el UCA y los primeros intermedios se unan y neutralicen el virus. Las mutaciones en el residuo N300 comienzan a ocurrir 1431 días después de la infección (Fig. 11 complementaria), momento en el que las variantes de glicina y tirosina cocirculan con las variantes de asparagina. Esto ocurre alrededor del tiempo en que las mutaciones LCDR3 próximas al residuo Env 300 ocurren en I2, DH270.1 y DH270.3, lo que sugiere que el virus en evolución se seleccionó para estas mutaciones en el clon. La comparación de las estructuras I3 e I2 unidas a Env indicó un pequeño cambio general en la configuración de su epítopo (Fig. 7D). Además, las estructuras de DH270.6 unidas a Env d526 que contiene G300 y Env d949 que contiene N300 muestran pocos cambios en la conformación general del epítopo (Fig. 7E y Fig. 14B complementaria). Dado que el efecto principal de las mutaciones de LCDR3 fue la rigidez de LCDR3 y un contacto más cercano con la base de glucano N301, con pocos cambios en la configuración del estado unido en los estados unidos o sin ligando, estos mutantes probablemente mejoraron la interacción al compensar el aumento de la flexibilidad del epítopo. . Los sitios Env coevolutivos adicionales fuera del bucle V1 y la posición 300 incluyeron las posiciones 325 a 327 en el motivo 324GDIR/K327 y la posición 328 (Fig. 11 complementaria a la derecha). También se produjeron mutaciones que eliminaron las secuencias de glucano N301, N332 y N442 a partir de los 1304 días posteriores a la infección. Los virus autólogos que eran resistentes al DH270.4 maduro se enriquecieron predominantemente para la sustitución de D325N, pero también tuvieron pérdida de glicanos en 301, 332 y/o 442. No se observó un impacto estructural claro para D325N mientras que los contactos cercanos en todos las estructuras con los glucanos sugieren que su pérdida tendría un gran impacto en la unión del anticuerpo DH270. Juntos, estos resultados muestran que la evolución del virus inició la evolución clonal de DH270 estabilizando el epítopo GDIR/K a través de G300N y eliminando la protección del bucle V1 largo del motivo V3 GDIR/K del bucle V3 conservado. El regreso de estas características protectoras probablemente estimuló la maduración del clon hacia la estabilización del paratope para combatir la flexibilidad mejorada, lo que resultó en una mayor amplitud de neutralización.

Aquí hemos estudiado una serie de estructuras crio-EM y las hemos correlacionado con el resultado de la afinidad del anticuerpo en un prototipo de clon de células B del anticuerpo V3-glicano VIH-1 ampliamente neutralizante. Demostramos que las primeras mutaciones G57R y S27Y que fueron necesarias para la adquisición de la amplitud heteróloga por parte del anticuerpo intermedio I5 alteraron la orientación del anticuerpo en relación con Env, y este cambio en la posición del anticuerpo probablemente afectó el desarrollo del anticuerpo aguas abajo. Los siguientes pasos en la maduración de la afinidad de DH270.6 involucraron la optimización de las interacciones con el glicano N332 con los intermedios I3 e I4 adquiriendo mutaciones alrededor de la interacción N332-glicano, aunque apuntando a diferentes brazos del glicano ramificado. La maduración de I4 a DH270.2 implicó la adquisición de mutaciones próximas al brazo N332-glucano D1 como las de I3, lo que sugiere que involucrar el brazo D1 en lugar del brazo D2/3 fue una mejor solución para optimizar la interacción N332-glucano. Si DH270.2 muestra que la selección de I4 no fue ideal, DH270.3 muestra el problema de pasar de una coyuntura crítica demasiado pronto. Después de I3, el desarrollo a I2 y DH270.1 junto con DH270.3 mostró un número considerable de mutaciones en LDCR3 y residuos adyacentes, adquiriendo I2 la mayor potencia y amplitud de neutralización. La modificación del paratope aguas abajo del intermedio I2 apareció más lejos del epítopo primario y probablemente actuó para afinar la afinidad, la amplitud y la potencia. Estos resultados mostraron que el desarrollo específico del sitio por etapas determinó el destino de la maduración de la afinidad clonal DH270 corriente abajo.

Un estudio reciente de un clon de células B de anticuerpos contra la hemaglutinina de la influenza ampliamente neutralizante sugirió que la maduración de la afinidad implica el desarrollo de un grupo diverso de soluciones potenciales a partir de las cuales una mayor optimización podría inducir una respuesta amplia4. De acuerdo con ese estudio, aquí encontramos que diferentes mutaciones resolvieron problemas similares presentados por el patógeno. Sin embargo, estas soluciones no fueron necesariamente igualmente efectivas, y el clon en desarrollo pareció evolucionar hacia soluciones óptimas para ganar afinidad como lo demuestra la similitud de la mutación del clado. Lo que respalda esta hipótesis de "pluripotencia" de anticuerpos desarrollada en base a un bnAb4 de influenza crea un problema desconcertante para el diseño de vacunas. Dado que se desean criterios de valoración específicos en los clones por su amplitud y propiedades de potencia, es probable que se requiera una dirección cuidadosa de las respuestas en desarrollo hacia estos criterios de valoración y lejos de las soluciones menos productivas para la neutralización de la amplitud.

Nuestros resultados indicaron que las soluciones a los problemas de emparejamiento de epítopo-paratopo, en lugar de ocurrir juntas, dieron como resultado la diversificación de clados. Visto desde la perspectiva del clon DH270 completo, el hecho de no adquirir una solución óptima limita la maduración de la afinidad adicional, como fue el caso de los miembros clonales DH270.1 y DH270.3. Por lo tanto, el hecho de no adquirir soluciones óptimas para el reconocimiento de antígenos en sitios problemáticos específicos al principio de la maduración del linaje bnAb puede dificultar la amplitud de neutralización del desarrollo favorable en miembros posteriores del linaje. En el contexto del clon DH270, la vacunación que no logra inducir la selección de las mutaciones I5 G57R y S27Y puede limitar la adquisición de las mutaciones I3 R98T y L48Y. Además, nuestros resultados demostraron cómo el clon DH270 tomó diferentes caminos para llegar a soluciones que diferían sustancialmente en la amplitud de neutralización del VIH-1. Saber qué sitios de epítopos pueden estar involucrados en la selección de mutaciones con una mejor amplitud de neutralización nos equipará mejor para seleccionar con precisión las modificaciones del inmunógeno que producirían una ganancia de afinidad diferencial positiva que favorezca la(s) mutación(es) deseada(s). A diferencia de I3, que contenía dos mutaciones críticas que probablemente resultarían en una ganancia de afinidad individualmente, I2 adquirió múltiples mutaciones LCDR3 que trabajaron juntas para modificar la interacción con Env. La necesidad de inducir múltiples mutaciones que pueden hacer poco para mejorar la afinidad individualmente probablemente requerirá pensar más allá de las propiedades del inmunógeno en cuestiones relacionadas con el adyuvante, el momento de la vacunación y el número e identidad de los inmunógenos potenciadores.

Si bien nuestro estudio se centra en la vía de maduración de un solo clon de bnAb dirigido a glucanos V3, existen varias similitudes entre diversos anticuerpos dirigidos a glucanos V3. Si bien los detalles específicos de sus rutas de maduración pueden diferir, los anticuerpos que se dirigen a este sitio tienen que eludir barreras estructurales similares para llegar a soluciones óptimas para adquirir una amplitud de neutralización heteróloga. La clave entre estas barreras estructurales incluye el bucle V1 que los anticuerpos en desarrollo deben eludir para acceder al motivo V3 GDIR/K conservado y los glucanos epitópicos, principalmente el glucano N332. De hecho, la capacidad de reconocer simultáneamente estos dos motivos estructurales define un bnAb de V3-glicano o un precursor. El clon DH270 demuestra que estos sitios del epítopo se involucran temprano en el desarrollo clonal con el DH270 UCA ya en una orientación que abarca el N332-glicano, siendo el siguiente paso en el desarrollo la adquisición de la mutación VH G57R para involucrar el V3 GDIK motivo. Por lo tanto, la orientación del anticuerpo entre paréntesis dentro del motivo V3 GDIR/K y el glicano N332, incluso durante las primeras etapas del desarrollo clonal donde se puede observar poca o ninguna amplitud de neutralización, es una firma estructural clave de un anticuerpo contra el glicano V3 que puede desarrollarse para adquirir amplitud de neutralización heteróloga. Esto contrasta con otros anticuerpos autólogos dirigidos hacia el vértice de Env del VIH-1 espacialmente proximales que se acoplan al motivo V3 GDIR/K pero no al N332-glicano31,32,33.

La evidencia emergente sugiere que una vacuna eficaz contra el VIH-1 requerirá la inducción de una respuesta bnAb policlonal dirigida a múltiples sitios de vulnerabilidad Env26. Un camino para realizar esta difícil tarea es diseñar inmunógenos que puedan seleccionar mutaciones conocidas de bnAb en células B precursoras de la línea germinal. El mapeo del desarrollo de anticuerpos bnAb en este estudio proporciona una hoja de ruta para el desarrollo de inmunógenos basados ​​en clones de tal precisión. Al aislar distintos elementos estructurales en la interfaz anticuerpo-antígeno, se pueden establecer sitios de ganancia y se pueden desarrollar inmunógenos para resolver secuencialmente problemas estructurales asociados con cada sitio individualmente. Al cambiar el enfoque a pasos específicos y manejables, el diseño de afinidad racional puede avanzar a través de una serie de objetivos bien definidos en lugar de intentar implementar un conjunto especulativo de diseños de inmunógenos finales que carecen de datos claros.

La inferencia estadística juega un papel clave en nuestro examen del anticuerpo del linaje DH270 y la coevolución de CH848 HIV-1 Env. La reconstrucción del árbol clonal de anticuerpos utiliza la inferencia estadística basada en la máxima verosimilitud para estimar las secuencias de anticuerpos de los nodos internos que representan los estados ancestrales del clon de células B y la precisión de este método está limitada por los datos de secuencia disponibles muestreados para el clon y el modelo evolutivo utilizado. Como tal, el árbol clonal para el clon DH270 utilizado aquí y en otros estudios8,34, representa la mejor estimación dados los parámetros predeterminados del programa Cloanalyst35 y los datos de secuencia de los 6 pares de cadenas pesadas y ligeras del clon DH270 recuperados por análisis de antígenos. Clasificación específica de células B individuales. Nuestro análisis de secuencia longitudinal de Env también depende de la inferencia estadística y la relación entre la neutralización del virus miembro del linaje clonal y la probabilidad de que se seleccione una característica particular de Env para los cambios de anticuerpos que mejoran la respiración. Nuestros informes sobre los efectos estructurales de las mutaciones del anticuerpo del linaje DH270 y los efectos específicos de la mutación Env en el contexto de la coevolución dependen, por lo tanto, de la veracidad de estas inferencias. Además, se desconoce la secuencia exacta de Env que inició el linaje y el número de secuencias diferentes que impulsaron el desarrollo del linaje clonal DH270.

Si bien los cambios en el virus y el clon del anticuerpo ocurrieron simultáneamente durante la coevolución natural, la mayoría de nuestras observaciones estructurales se basan en el uso de un solo Env, que es un trímero SOSIP soluble derivado de un virus aislado del individuo CH848 el día 949 después de transmisión. Aunque esto impidió una réplica estructural fiel del proceso de coevolución, nos permitió mantener el conjunto de datos manejable y al mismo tiempo obtener información significativa sobre la coevolución al centrarnos en cambios específicos de residuos de Env que fueron determinantes en la aparición de resistencia y en la conducción. evolución de anticuerpos. Nuestra estrategia nos permitió estudiar los efectos de los cambios de residuos de anticuerpos sin confundirnos con cambios simultáneos en Env. Finalmente, agregamos más información sobre la coevolución mediante el estudio de Env seleccionados con propiedades de neutralización diferencial y barreras estructurales para la participación de anticuerpos que surgieron en diferentes puntos temporales.

Las células Expi293 (ThermoFisher Cat No. A14527) se diluyeron hasta un volumen final de 0,5 L a una concentración de 2,5 × 106 células mL-1 en medios Expi293. Cuatrocientos microgramos de plásmido de cadena pesada y cadena ligera se acomplejaron con Expifectamine (ThermoFisher Cat No. A14526) y se añadieron a las células Expi293. El día cinco, las células se eliminaron del medio de cultivo de células de transfección mediante centrifugación y filtración 0,8 μM. El sobrenadante que contenía el anticuerpo recombinante se incubó con resina de proteína A (ThermoFisher) durante la noche a 4 °C. La resina de proteína A se recogió por centrifugación y se eliminó el sobrenadante del cultivo. La resina se lavó con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un total de NaCl 340 mM. Se usaron un total de 30 ml de glicina 10 mM pH 2,4, NaCl 150 mM para eluir el anticuerpo de la resina de proteína A. El pH de la solución de anticuerpo eluida se aumentó a aproximadamente 7 mediante la adición de Tris 1 M, pH 8,0. La solución de anticuerpo se cambió de tampón a PBS con sucesivas rondas de centrifugación, se filtró y se almacenó a -80 °C.

La producción de sobres CH848 SOSIP gp140 se realizó con células Freestyle293 (ThermoFisher Cat No. R79007). El día de la transfección, Freestyle293 se diluyó a 1,25 × 106 células/mL con medio Freestyle293 fresco hasta un volumen total de 1 L. Las células se cotransfectaron con 650 μg de ADN plasmídico que expresa SOSIP y 150 μg de ADN plasmídico que expresa furina complejado con 293Fectin (ThermoFisher Cat No. 12347019). El día 6, los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron mediante centrifugación del cultivo celular durante 30 min a 3500 rpm. El sobrenadante libre de células se filtró a través de un filtro de 0,8 μm y se concentró a menos de 100 ml con un casete de filtración de flujo tangencial de un solo uso y se filtró de nuevo a 0,8 μm. La proteína Env trimérica se purificó con cromatografía de afinidad con anticuerpo monoclonal PGT145. La resina acoplada a PGT145 se empaquetó en una columna Tricorn (GE Healthcare) y se almacenó en PBS suplementado con azida de sodio al 0,05 %. El sobrenadante sin células se aplicó a la columna a 2 ml/min usando un AKTA Pure (GE Healthcare), se lavó y la proteína se eluyó de la columna con MgCl2 3M. El eluato se diluyó inmediatamente en Tris 10 mM, pH 8, se filtró por 0,2 µm y se concentró hasta 2 ml para la cromatografía de exclusión por tamaño. La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó con una columna Superose 6 16/600 (GE Healthcare) en Tris 10 mM pH 8, NaCl 500 mM. Las fracciones que contenían la proteína trimérica Env del VIH-1 se combinaron, se esterilizaron por filtración, se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C.

Las curvas de unión de SPR de los Fabs de los linajes DH270 contra CH848 DS SOSIP Trimer se obtuvieron utilizando un instrumento Biacore S200 (Cytiva) en tampón de ejecución HBS-N 1x o un instrumento Biacore 3000 (Cytiva) en PBS 1x pH 7,4. Para las mediciones de afinidad de DH270 Fabs I5.6, I3.6, I2.6 y DH270.6, se inmovilizó CH848 DS SOSIP Trimer biotinilado en un chip sensor CM3 a través de estreptavidina a un nivel de 280–290RU. Utilizando el tipo de inyección de ciclo único, se inyectaron seis inyecciones secuenciales de Fabs diluidos de 50 a 1500 nM sobre el trímero SOSIP inmovilizado a 50 µl/min durante 120 s por concentración seguido de un período de disociación de 600 s. Los Fab se regeneraron con un pulso de 20 s de NaOH 25 mM a 50 µl/min. Los resultados se analizaron utilizando el software de evaluación Biacore S200 (Cytiva). Se usó una superficie de estreptavidina en blanco así como unión de tampón para la sustracción de referencia doble para tener en cuenta la unión de anticuerpos no específicos y la desviación de la señal. Los análisis de ajuste de curvas se realizaron usando el modelo de Langmuir 1:1 con un Rmax local. Para DH270UCA3 Fab, se inmovilizó CH848 DS SOSIP Trimer biotinilado en un sensor CM5 a través de estreptavidina a un nivel de 290–300RU. DH270UCA3 Fab se diluyó de 500 a 3000 nM y cada concentración se inyectó sobre la superficie SOSIP Trimer durante 300 s usando el tipo de inyección K-inject a 50 µL/min. Un período de disociación de 600 s fue seguido por una regeneración de la superficie con un pulso de 20 s de NaOH 50 mM. Los resultados se analizaron utilizando el software de evaluación BIA (Cytiva). Se usó una superficie de estreptavidina en blanco y unión de tampón para la sustracción de referencia doble. El análisis de ajuste de curvas de DH270UCA3 Fab se realizó usando el modelo de Langmuir 1:1 con un Rmax local. Las curvas de unión notificadas para todos los Fab son representativas de un conjunto de datos.

Los complejos de trímero CH848 SOSIP se prepararon utilizando una solución madre de 2 mg/ml de trímero incubada con un exceso molar de seis veces de Fab. Para evitar la interacción de los complejos trímeros con la interfaz aire-agua durante la vitrificación, las muestras se incubaron en n-dodecil β-D-maltósido (DDM) 0,085 mM. Las muestras se aplicaron a rejillas de carbón perforado QUANTIFOIL limpiadas con plasma (EMS, malla R1.2/1.3 Cu 300) seguido de un período de adsorción de 30 s y transferencia con papel de filtro. A continuación, la rejilla se congeló por inmersión en etano líquido usando un congelador por inmersión EM GP2 (Leica, 90-95% de humedad relativa).

Las imágenes Cryo-EM se realizaron en un microscopio FEI Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV. Las imágenes de recopilación de datos se adquirieron con un detector de electrones directo Falcon 3EC o K3 operado en modo de conteo con un tamaño de píxel físico calibrado de 1,08 Å con un rango de desenfoque entre −1,0 y −3,5 µm utilizando el software EPU (Thermo Fisher Scientific). No se instaló ningún filtro de energía ni corrector Cs en el microscopio. La tasa de dosis utilizada fue ~0,8 e-/Å2 s para garantizar el funcionamiento en el rango lineal del detector. El tiempo de exposición total fue de 60 s, y los fotogramas intermedios se registraron cada 2 s dando una dosis acumulada de ∼42 e-/Å2 y un total de 30 fotogramas por imagen.

La calidad de la imagen Cryo-EM se controló sobre la marcha durante la recopilación de datos mediante rutinas de procesamiento automatizado. Para los conjuntos de datos DH270.I3, DH270.I2, DH270.6, DH270.I4 y DH270.2, el procesamiento de datos se realizó dentro de cryoSPARC36, incluida la selección de partículas, múltiples rondas de clasificación 2D, reconstrucción ab initio, refinamiento de mapas homogéneos y no refinamiento uniforme del mapa. El resto de los conjuntos de datos se procesaron adicionalmente fuera de cryoSPARC para mejorar la calidad del mapa, como se describe a continuación. La alineación de los fotogramas de la película se llevó a cabo con UNBLUR37 y la determinación de CTF con CTFFIND438. Las partículas se seleccionaron automáticamente utilizando un disco gaussiano de 80 Å de radio como plantilla de búsqueda. Todas las partículas seleccionadas se extrajeron con un tamaño de caja de 384 píxeles y se redujeron a 192 píxeles (agrupación 2) y se sometieron a 8 rondas de refinamiento en cisTEM39, usando un modelo ab-initio generado con cryoSPARC36. La distribución de las puntuaciones asignadas a cada partícula por cisTEM mostró una clara distribución bimodal y solo se seleccionaron las partículas del grupo que contenía las puntuaciones más altas para su posterior procesamiento. El subconjunto limpio de partículas se volvió a extraer sin agrupar y se sometió a 10 iteraciones de refinamiento local seguidas de 5 iteraciones adicionales utilizando una máscara de forma generada con EMAN240. Luego se llevó a cabo el refinamiento de CTF por partícula hasta que no se observó ninguna mejora adicional en la curva de FSC. En este punto, los cuadros de partículas se volvieron a extraer de los datos sin procesar y se sometieron a corrección de movimiento por partícula utilizando todos los cuadros de película y aplicando un esquema de ponderación de dosis basado en datos41. Las nuevas partículas alineadas localmente se exportaron a cryoSPARC para realizar una ronda adicional de refinamiento homogéneo y refinamiento no uniforme.

Para el análisis del ángulo del codo con DH270.I3, I4 y DH270.5, el refinamiento del foco local con las partículas limpias después de la expansión de la simetría se realizó en cryoSPARC. Luego, las partículas junto con los parámetros de refinamiento correspondientes se exportaron a RELION 3.142 para realizar una clasificación 3D sin alineación usando T=25.

Las estructuras de cada anticuerpo se prepararon utilizando Modeller43 y las estructuras de cristal Fab disponibles20,30. Las estructuras SOSIP Env se prepararon utilizando un modelador y el trímero de día 949 CH848 unido a DH270.6 (PDB ID 6UM6 cadenas A y B)21. Coordenadas para VRC01 de PDB ID 3NGB44 (cadenas H y L). El ajuste de la estructura de los mapas crio-EM se realizó en ChimeraX45 utilizando la aplicación Isolde46. Las estadísticas de ajuste de estructura y calidad del mapa se determinaron utilizando MolProbity47 y EMRinger48, respectivamente. Los glicanos se ajustaron usando una combinación de mapas afilados y filtrados gaussianos (desviación estándar de 1,0 a 1,5). Los análisis de estructura y mapa se realizaron usando una combinación de PyMol49 y ChimeraX con ángulos theta y phi calculados usando VMD50. Los mapas de potencial electrostático se generaron en PyMol.

La unión del anticuerpo a las proteínas SOSIP se probó utilizando placas ELISA de 384 pocillos que se recubrieron con 2 mcg/ml de anticuerpo en bicarbonato de sodio 0,1 M durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con PBS/Tween-20 al 0,05 % y se bloquearon con diluyente de ensayo (PBS que contenía 4 % (p/v) de proteína de suero/suero de cabra normal al 15 %/Tween-20 al 0,5 %/azida sódica al 0,05 %) a temperatura ambiente durante 1 hora Se añadió proteína SOSIP purificada en diluciones en serie de 2 veces a partir de 10 mcg/ml durante 1 h seguido de lavado. La unión de SOSIP a los anticuerpos recubiertos se detectó utilizando el anticuerpo humano biotinilado PGT151 a 0,125 mcg/ml durante 1 hora. Se lavó PGT151 y se siguió con estreptavidina-HRP (Thermo Scientific # 21130) 1:30,000 durante 1 h. Las placas se lavaron 4 veces y se revelaron con sustrato TMB (SureBlue Reserve-#5120-0083) seguido de HCl 1 M para detener la reacción. Finalmente, se determinó la absorbancia a 450 nm (OD450) con un lector de placas de 384 pocillos (Molecular Devices, Spectramax 384 plus).

Las secuencias de Env utilizadas para el análisis de la firma son de Bonsignori et al.20. La herramienta web AnalyzeAlign en la base de datos de VIH de Los Alamos se utilizó para generar logotipos de secuencias. Los datos de neutralización autóloga son de Bonsignori et al.20. medido en 90 pseudovirus Env autólogos, incluido el TF y Env longitudinales representativos muestreados entre 78 y 1720 días después de la infección. Mientras que los intermedios en el estudio anterior se infirieron con 5 clones miembros en lugar de 6 como en este estudio actual, los intermedios I5, I3 e I2 se corresponden muy de cerca con IA4, IA2 e IA1, respectivamente en Bonsignori et al.20.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las reconstrucciones Cryo-EM y los modelos atómicos generados durante este estudio están disponibles en wwPDB y EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) con los siguientes códigos de acceso: Cryo-EM reconstrucciones y modelos atómicos generados durante este están disponibles en wwPDB y EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) con los siguientes códigos de acceso: ID de EMD: EMD-40282, EMD-40283, EMD-40285, EMD-40286, EMD -40287, EMD-40288, EMD-40291, EMD-40290, EMD-40289, EMD-40284, EMD-40280, EMD-40280, EMD-40278, EMD-40277, EMD-40275, EMD-40281, EMD-40279 , EMD-40274, EMD-40273 e ID de PDB: 8SAW, 8SAX, 8SAZ, 8SB0, 8SB1, 8SB2, 8SB5, 8SB4, 8SB3, 8SAY, 8SAU, 8SAU, 8SAS, 8SAR, 8SAQ, 8SAV, 8SAT, 8SAN, 8SAL.

Vajda, S., Porter, KA & Kozakov, D. Progreso hacia una mejor comprensión de la maduración de anticuerpos. actual Opinión Estructura. Biol. 67, 226–231 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mishra, AK & Mariuzza, RA Información sobre la base estructural de la maduración de la afinidad de los anticuerpos a partir de la secuenciación de próxima generación. inmunol frontal. 9, 117 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wardemann, H. & Busse, CE Nuevos enfoques para analizar repertorios de inmunoglobulinas. Tendencias Immunol. 38, 471–482 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

McCarthy Kevin, R., Raymond Donald, D., Do Khoi, T., Schmidt Aaron, G. y Harrison Stephen, C. Maduración de la afinidad en una respuesta humoral humana a la hemaglutinina de la influenza. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 26745–26751 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt, AG y col. Preconfiguración del sitio de unión al antígeno durante la maduración por afinidad de un anticuerpo del virus de la influenza ampliamente neutralizante. proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos 110, 264 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Henderson, R. et al. La selección de mutaciones en la región del codo de inmunoglobulina afecta la flexibilidad conformacional entre dominios en los anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH-1. Nat. común 10, 654 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonsignori, M. et al. Vía de maduración desde la línea germinal hasta un amplio neutralizador de VIH-1 de un anticuerpo imitador de CD4. Celda 165, 449–463 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, JO, Zaidi, HA, Ton, T. & Fera, D. Los efectos de las mutaciones del marco en la interfaz de dominio variable sobre la maduración de la afinidad del anticuerpo en un linaje de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH-1. inmunol frontal. 11, 1529 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eisen, HN Mejora de la afinidad de los anticuerpos: cómo los anticuerpos de baja afinidad producidos temprano en las respuestas inmunitarias son seguidos por anticuerpos de alta afinidad más tarde y en las respuestas de células B de memoria. Inmunología del cáncer. Res. 2, 381–392 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stephenson, KE, Wagh, K., Korber, B. & Barouch, DH Vacunas y anticuerpos ampliamente neutralizantes para la prevención del VIH-1. año Rev. Inmunol. 38, 673–703 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Laursen, NS & Wilson, IA Anticuerpos ampliamente neutralizantes contra los virus de la influenza. antivirus Res. 98, 476–483 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Saunders, KO et al. Vacuna de anticuerpos neutralizantes para coronavirus pandémicos y preemergentes. Naturaleza 594, 553–559 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mu, Z., Haynes, BF & Cain, DW Estrategias para obtener múltiples linajes de anticuerpos ampliamente neutralizantes contra el VIH mediante la vacunación. actual Opinión Virol. 51, 172–178 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, BF, Kelsoe, G., Harrison, SC y Kepler, diseño de inmunógeno de linaje de células B de TB en el desarrollo de vacunas con VIH-1 como estudio de caso. Nat. Biotecnología. 30, 423–433 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, Barton F. et al. Interacciones VIH-huésped: implicaciones para el diseño de vacunas. Microbio huésped celular 19, 292–303 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klein, F. et al. Por lo general, se requieren mutaciones somáticas del marco de la inmunoglobulina para una neutralización amplia y potente del VIH-1. Celda 153, 126–138 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiehe, K. et al. Relevancia funcional de mutaciones de anticuerpos improbables para el desarrollo de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH. Cell Host Microbe 23, 759–765.e756 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, BF, Kelsoe, G., Harrison, SC y Kepler, diseño de inmunógeno de linaje de células B de TB en el desarrollo de vacunas con VIH-1 como estudio de caso. Nat. Biotecnología. 30, 423–433 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Liao, HX et al. Coevolución de un anticuerpo VIH-1 ampliamente neutralizante y virus fundador. Naturaleza 496, 469–476 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonsignori, M. et al. Inducción por etapas de anticuerpos ampliamente neutralizantes dependientes de glucanos del VIH-1. ciencia Traducir Medicina. 9, eaai7514 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Saunders, KO et al. Selección dirigida de mutaciones de anticuerpos específicos del VIH mediante ingeniería de maduración de células B. Ciencia 366, eaay7199 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ward, AB & Wilson, IA Información sobre la estructura de la glicoproteína trimérica de la cubierta del VIH-1. Tendencias Bioquímica. ciencia 40, 101–107 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steichen, JM et al. Una estrategia generalizada de diseño de vacunas contra el VIH para el cebado de respuestas de anticuerpos ampliamente neutralizantes. ciencia (Nueva York, Nueva York) 366, eaax4380 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Torrents de la Peña, A. et al. Mejora de la inmunogenicidad de los trímeros de envoltura de VIH-1 de tipo nativo mediante hiperestabilización. Representante celular 20, 1805–1817 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Moyo, T., Kitchin, D. & Moore, PL Dirigirse al supersitio N332 de la envoltura del VIH-1 para el diseño de vacunas. Opinión de experto. Objetivos terapéuticos 24, 499–509 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Haynes, BF et al. Estrategias para vacunas contra el VIH-1 que inducen anticuerpos ampliamente neutralizantes. Nat. Rev. Inmunol. 23, 142–158 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Griffith, SA & McCoy, LE To bnAb or Not to bnAb: definición amplia de anticuerpos neutralizantes contra el VIH-1. Frente. inmunol. 12, 708227 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anthony, C. et al. La cooperación entre las respuestas de neutralización amplia y específica de la cepa limitó el escape viral y prolongó la exposición del epítopo de neutralización amplia. J.Virol. 91, e00243–18 (2017).

Artículo Google Académico

Swanson, O. et al. Selección rápida de envolturas de VIH que se unen a miembros del linaje de células B de anticuerpos neutralizantes con mutaciones improbables funcionales. Rep. celular 36, 109561 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fera, D. et al. El imitador de la región V3 de la envoltura del VIH incorpora características clave de un epítopo de linaje de anticuerpo ampliamente neutralizante. Nat. común 9, 1111 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nogal, B. et al. Los anticuerpos neutralizantes autólogos provocados por el trímero de la envoltura del VIH se unen a una región que se superpone al supersitio de glicano N332. ciencia Adv. 6, eaba0512 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiehe, K. et al. Diseño de vacunas guiadas por mutación: una estrategia para desarrollar inmunógenos estimulantes para la inducción de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH. bioRxiv, 2022.2011.2011.516143. 10.1101/2022.11.11.516143 (2022).

Kepler, TB Reconstrucción de un linaje clonal de células B. I. Inferencia estadística de ancestros no observados. F1000Res. 2, 103 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Saunders, KO et al. La inmunización estabilizada de la cubierta del VIH-1 induce anticuerpos neutralizantes contra los CD4bs y protege a los macacos contra la infección de las mucosas. ciencia Traducir Medicina. 14, eabo5598 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Escolano, A. et al. La inmunización expande las células B específicas del glicano V3 del VIH-1 en ratones y macacos. Naturaleza 570, 468–473 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ y Brubaker, MA cryoSPARC: algoritmos para la determinación rápida de estructuras crio-EM sin supervisión. Métodos Nat. 14, 290 (2017).

Grant, T. & Grigorieff, N. Midiendo la exposición óptima para crio-EM de una sola partícula usando una reconstrucción de 2.6 Å de rotavirus VP6. Elife 4, e06980 (2015).

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: Estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J Struct Biol. 192, 216–221 (2015).

Grant, T., Rohou, A. & Grigorieff, N. cisTEM, software fácil de usar para el procesamiento de imágenes de partículas individuales. eLife 7, e35383 (2018).

Tang, G. et al. EMAN2: una suite de procesamiento de imágenes extensible para microscopía electrónica. J Struct Biol. 157, 38–46 (2007).

Bartesaghi, A. et al. Resolución atómica Cryo-EM Estructura de β-galactosidasa. Estructura 26, 848–856.e843 (2018).

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. eLife 7, e42166 (2018).

Eswar, N. et al. en Protocolos actuales en ciencia de proteínas (John Wiley & Sons, Inc). (2001).

Zhou, T. et al. Base estructural para la neutralización amplia y potente del VIH-1 por el anticuerpo VRC01. Ciencia 329, 811 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX: visualización de estructuras para investigadores, educadores y desarrolladores. Ciencia de las proteínas : una publicación. Sociedad de Proteínas 30, 70–82 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Croll, T. ISOLDE: un entorno físicamente realista para la construcción de modelos en mapas de densidad electrónica de baja resolución. Acta Crystallogr. Secta. D. 74, 519–530 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Chen, VB et al. MolProbity: validación de estructuras de todos los átomos para cristalografía macromolecular. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 12–21 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Barad, BA et al. EMRinger: modelo dirigido por cadenas laterales y validación de mapas para microscopía crioelectrónica 3D. Nat. Métodos 12, 943 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schrodinger, L. El sistema de gráficos moleculares PyMOL. (2015).

Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: Dinámica molecular visual. J. Mol. Grafico. 14, 33–38 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Los datos de Cryo-EM se recopilaron en Duke Krios en la Instalación de Instrumentación de Materiales Compartidos (SMIF) de la Universidad de Duke, miembro de la Red de Nanotecnología del Triángulo de Investigación de Carolina del Norte (RTNN), que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (premio número ECCS-2025064 ) como parte de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI), y en el Centro Nacional de Acceso y Capacitación de Cryo-EM (NCCAT) y el Centro de Microscopía Electrónica Simons ubicado en el Centro de Biología Estructural de Nueva York, respaldado por el Fondo Común Transformativo de NIH Programa de microscopía crioelectrónica de alta resolución (U24 GM129539) y por subvenciones de la Fundación Simons (SF349247) y el estado de Nueva York. Este estudio utilizó los recursos computacionales ofrecidos por Duke Research Computing (http://rc.duke.edu; NIH 1S10OD018164-01) en la Universidad de Duke. Agradecemos a Advaiti Kane y Parth Patel por el análisis de antigenicidad de los trímeros. Financiamiento: Este proyecto fue apoyado por NIH, NIAID, División de AIDS Consortia for HIV/AIDS Vaccine Development (CHAVD) Grant UM1AI144371 (BFH), R01AI145687 (PA), NIAID Center for Structural Biology U54AI170752 (PA), NIGMS Grant R01GM141223 (AB) ) y Translating Duke Health Initiative (PA y RCH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Rory Henderson, Ye Zhou.

Departamento de Medicina e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

Rory Henderson, Kevin Wiehe, S. Munir Alam y Barton F. Haynes

Instituto de Vacunas Humanas de Duke, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

Rory Henderson, Victoria Stalls, Kevin Wiehe, Kevin O. Saunders, Kara Anasti, Maggie Barr, Robert Parks, S. Munir Alam, Barton F. Haynes y Priyamvada Acharya

Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

Ye Zhou y Alberto Bartesaghi

Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

Kevin O. Saunders y Priyamvada Acharya

Biología Teórica y Biofísica, Laboratorio Nacional de Los Alamos, Los Alamos, NM, EE. UU.

Kshitij Wagh y Bette Korber

Consorcio de Nuevo México, Los Álamos, NM, EE. UU.

Kshitij Wagh y Bette Korber

Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

San Munir Alam

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

Alberto Bartesaghi y Priyamvada Acharya

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

alberto bartesaghi

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

RH, AB y PA dirigieron el estudio; RH, YZ, VS y PA determinaron y analizaron estructuras crio-EM; VS proteínas expresadas y purificadas; KOS supervisó la expresión y purificación de proteínas; Ks.W. y BK realizaron y analizaron firmas de neutralización; KA realizó ensayos SPR; ensayos SPR supervisados ​​por SMA; MB y RP realizaron ensayos ELISA. RH escribió y editó el manuscrito con la ayuda de todos los autores. BFH y PA diseñaron, editaron y obtuvieron fondos para el estudio. PA supervisó el estudio y revisó todos los datos.

Correspondencia a Rory Henderson, Barton F. Haynes, Albert Bartesaghi o Priyamvada Acharya.

Los autores declaran los siguientes intereses contrapuestos: La Universidad de Duke ha presentado una solicitud de patente que cubre las modificaciones del sobre del VIH-1 basadas en este estudio. No hay restricciones de uso científico basadas en esta presentación.

Nature Communications agradece a Xueling Wu y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Henderson, R., Zhou, Y., Stalls, V. et al. Base estructural para el desarrollo de amplitud en el linaje clonal de anticuerpos DH270 dirigidos contra glucanos V3 del VIH-1. Nat Comun 14, 2782 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

Descargar cita

Recibido: 10 Agosto 2022

Aceptado: 14 abril 2023

Publicado: 15 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.