Una vacuna de subunidad candidata induce inmunidad protectora contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en ratones

npj Vacunas volumen 8, Número de artículo: 72 (2023) Citar este artículo

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Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) causa paratuberculosis (PTB), que es una enteritis granulomatosa en rumiantes que amenaza el desarrollo saludable de la industria láctea y la seguridad de la salud pública en todo el mundo. Debido a que las vacunas inactivadas comerciales no son completamente protectoras e interfieren con el diagnóstico de la tuberculosis bovina, probamos cuatro proteínas de fusión, a saber, 66NC, 66CN, 90NC y 90CN, que se construyeron con MAP3527, Ag85B y Hsp70 de MAP en diferentes combinaciones en tándem. En particular, 66NC, que codifica una proteína de fusión de 66 kDa que combina en orden lineal MAP3527N40–232, Ag85B41–330 y MAP3527C231–361, indujo una respuesta potente y específica de IFN-γ. La inmunización de ratones C57BL/6 con la proteína de fusión 66NC formulada en adyuvante Montanide ISA 61 VG generó respuestas inmunitarias robustas de tipo Th1, Th2 y Th17 y fuertes respuestas de anticuerpos. La vacuna 66NC protegió a los ratones C57BL/6 contra la infección virulenta MAP K-10. Esto se tradujo en una reducción de la carga bacteriana y una mejora del daño patológico en el hígado y el intestino, además de una reducción de la pérdida de peso corporal; También se indujo una protección significativamente mejor que la vacuna 74 F informada. Además, la eficacia de la vacuna se correlacionó con los niveles de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos del antígeno secretor de IFN-γ-, TNF-α- e IL-17A, así como con los niveles séricos de IFN-γ y TNF-α después de la vacunación. Estos resultados demuestran que la proteína recombinante 66NC es una candidata eficiente para un mayor desarrollo en una vacuna protectora en términos de inducir protección específica contra MAP.

Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) causa paratuberculosis (PTB), comúnmente conocida como enfermedad de Johne, que es una inflamación granulomatosa a largo plazo de los intestinos de los rumiantes domésticos y salvajes. La pérdida de peso, la diarrea intensa y la disminución de la producción de leche y de la condición corporal se encuentran entre los signos clínicos asociados con esta afección a medida que avanza1. La PTB muestra una distribución mundial y una alta incidencia, y amenaza el desarrollo sustentable y saludable de la industria láctea2,3. Se estima que la mayoría de los rebaños lecheros de EE. UU., aproximadamente el 90 %, están infectados con MAP4, lo que genera una pérdida económica anual de alrededor de 250 millones de dólares en los Estados Unidos3. Además, MAP se ha detectado en fórmula infantil en polvo y leche pasteurizada minorista5,6, y el patógeno se ha encontrado en numerosas enfermedades humanas, como la enfermedad de Crohn, la diabetes tipo I y la tiroiditis de Hashimoto7,8,9, que amenazan la salud pública mundial y seguridad socioeconómica.

A pesar de la gravedad de la PTB en los rumiantes, no se ha desarrollado una vacuna eficaz. Tres vacunas utilizadas anteriormente (Mycopar, Silirum y Gudair) son MAP de células enteras inactivadas formuladas en emulsiones de aceite. Sin embargo, estas vacunas no son completamente protectoras1 y causan granulomas locales y formación de abscesos en el sitio de la inyección, siendo probablemente el principal obstáculo la interferencia con una prueba de diagnóstico empleada regularmente para la tuberculosis bovina y PTB1,10. Para cualquier programa efectivo de control de PTB, el factor más importante es reducir la eliminación fecal de MAP. Sin embargo, se ha encontrado que las vacunas inactivadas solo provocan una reducción mínima en la excreción fecal11,12. Por lo tanto, los investigadores en los Estados Unidos trabajaron juntos a través del Programa Integrado de la Enfermedad de Johne y utilizaron un enfoque de desactivación de genes para desarrollar vacunas vivas modificadas, que parecen detener la eliminación fecal de MAP1,10. De hecho, las vacunas MAP vivas atenuadas brindan una mejor protección, pero no se elimina la posible interferencia en las pruebas de diagnóstico de la tuberculosis. Además, la posibilidad de exposición humana involuntaria a MAP vivo modificado también es un problema de salud pública considerable13,14.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de vacunas innovadoras y eficaces contra la PTB que no interfieran con el diagnóstico de la TB bovina. Para abordar estos problemas, los investigadores están explorando una variedad de soluciones, como vacunas de subunidades y vacunas basadas en ADN. La proteína de choque térmico MAP 70 (Hsp70) es un antígeno inmunodominante15, y la vacuna recombinante MAP Hsp70 reduce la eliminación de bacterias en las heces durante un período prolongado en terneros16. Un estudio ha revelado que la vacuna Hsp70 no impide el reconocimiento de la tuberculosis, y los animales vacunados con Hsp70 se distinguen fácilmente de los infectados con MAP17. El ganado bovino y los ratones infectados con MAP inducen una respuesta de células T rápida y fuerte contra las proteínas del filtrado de cultivo en general y las proteínas Ag85B en particular18. El MAP Ag85B recombinante emulsionado en adyuvante Ribi indujo una respuesta inmunitaria de tipo Th1 y Th219. El antígeno Ag85B de MAP se expresó en alfalfa transgénica y provocó inmunidad duradera en ratones20. Una proteína de fusión 74 F que consiste en MAP3527 y MAP1519 mezclados con el adyuvante MPL y otra vacuna de partículas de proteína de fusión que contiene antígenos MAP Ag85A-SOD-Ag85B-74F protegió eficazmente a los ratones contra la infección por MAP21,22. Además, una cepa atenuada de Salmonella portadora de los genes SopE104-Ag85A-SOD-Ag85B y SopE104-74F provocó una respuesta inmunitaria Th1 robusta y persistente caracterizada por la producción de IFN-γ, lo que brinda protección en ratones contra el desafío de MAP23. Para desarrollar vacunas de subunidades contra la PTB, es importante identificar antígenos micobacterianos que activen preferentemente las células T CD4+ y CD8+ para proliferar y secretar IFN-γ1,21,24. Estudios previos han identificado tres antígenos MAP (MAP3527, Ag85B y Hsp70) en condiciones de infección controlada en ovejas, bovinos y ratones caracterizados por su capacidad para inducir respuestas de células T y anticuerpos16,18,21. En este estudio, construimos cuatro proteínas de fusión combinando en tándem MAP3527, Ag85B y Hsp70 en diferentes combinaciones, denominadas 66NC, 66CN, 90NC y 90CN, según su peso molecular. Investigamos más a fondo las propiedades inmunoprotectoras de estas proteínas de fusión en un modelo de ratón.

En particular, los modelos de infección de rumiantes se utilizan ampliamente para los estudios de vacunación de PTB24,25. Sin embargo, debido a la larga incubación de la enfermedad en los rumiantes y al costo de realizar experimentos, se han desarrollado animales de laboratorio no rumiantes como sustituto de los rumiantes. Los ratones C57BL/6 se utilizan con frecuencia como modelos para investigar las infecciones por MAP y el desarrollo de vacunas21,26,27. Este estudio se centra en la inmunogenicidad y la eficacia protectora de la proteína de fusión 66NC formulada con el adyuvante Montanide ISA 61 VG, que se estudió y comparó con la poliproteína 74 F en un modelo murino.

Se muestra una representación esquemática de 66NC, 66CN, 90NC y 90CN que muestra la organización y los sitios de las enzimas de restricción (EcoR I y Hind III) utilizados para construir la proteína de fusión y los datos sobre la purificación de la proteína utilizando una etiqueta de seis histidinas en el extremo N. en la figura 1a. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cuatro proteínas de fusión están disponibles en la Secuencia complementaria 1. Las longitudes ORF de 66NC, 66CN, 90NC y 90CN son 1902 pb, 1902 pb, 2547 pb y 2547 pb, que codifican 653 aa, 653 aa, 868 aa y 838 aa, respectivamente, con masas moleculares previstas de ~66 kDa, ~66 kDa, ~90 kDa y ~90 kDa, respectivamente. La proteína recombinante expresada en E. coli se purificó mediante cromatografía de afinidad en columna de Ni (Fig. 1b-d). La purificación de la poliproteína 74 F se realizó siguiendo informes previos21 y se analizó mediante SDS-PAGE (Fig. 1e).

una representación esquemática de las construcciones 66NC, 66CN, 90NC y 90CN. b Purificación de una proteína de fusión 90CN recombinante. línea M, marcador de peso molecular de proteína; línea 1, proteína 90CN después de la renaturalización; línea 2, flujo continuo desde la resina; línea 3, resina unida a proteínas antes del lavado; línea 4, resina unida a proteínas después del lavado; línea 5, proteína 90CN purificada eluida con imidazol 500 mM. c Purificación de una proteína de fusión 90NC recombinante. línea M, marcador de peso molecular de proteína; línea 1, proteína 90NC después de la renaturalización; línea 2, flujo continuo desde la resina; línea 3, resina unida a proteínas antes del lavado; línea 4, resina unida a proteínas después del lavado; línea 5, proteína 90NC purificada eluida con imidazol 500 mM. d Purificación de la proteína de fusión recombinante 66CN y 66NC. línea M, marcador de peso molecular de proteína; línea 1, flujo continuo desde la resina; línea 2, resina unida a proteínas antes del lavado; línea 3, resina unida a proteínas después del lavado; líneas 4 y 5, proteína 66CN purificada eluida con imidazol 500 mM y 1 M, respectivamente; línea 6, resina unida a proteínas después de la elución; línea 7, flujo continuo desde la resina; línea 8, resina unida a proteínas antes del lavado; línea 9, resina unida a proteínas después del lavado; línea 10 y 11, proteína 66NC purificada eluida con imidazol 500 mM y 1 M, respectivamente. e Purificación de una proteína de fusión 74 F recombinante. línea M, marcador de peso molecular de proteína; línea 1, flujo continuo desde la resina; línea 2, resina unida a proteínas antes del lavado; línea 3, resina unida a proteínas después del lavado; líneas 4 y 5, proteína 74 F purificada eluida con imidazol 200 mM y 500 mM, respectivamente. Todos los geles derivan del mismo experimento y fueron procesados en paralelo.

El IFN-γ es fundamental para combatir los patógenos intracelulares, como las micobacterias28,29. Para seleccionar los adyuvantes y las vías de inmunización óptimos, inmunizamos ratones por vía subcutánea o intramuscular con proteína de fusión 66NC emulsionada con Montanide ISA 61 VG, Montanide GEL 02 PR o Montanide ISA 206 VG. Tres semanas después de la segunda inmunización, se recolectaron esplenocitos de los ratones inmunizados para el ensayo ELISpot de IFN-γ (Fig. 2a). La inmunización subcutánea de ratones con 66NC formulado en adyuvante Montanide ISA 61 VG resultó en la producción de la respuesta de IFN-γ más fuerte después de la estimulación in vitro de cocultivos de linfocitos esplénicos con proteína de fusión 66NC en comparación con los de los otros 11 grupos (Fig. 2b , C). Para seleccionar los inmunógenos óptimos, inmunizamos ratones por vía subcutánea con adyuvante Montanide ISA 61 VG mezclado con proteína de fusión 66NC, 66CN, 90NC o 90CN. La inmunización de ratones con 66NC estimuló la producción más robusta de la reacción de IFN-γ contra la proteína de fusión 66NC en comparación con los ratones inmunizados con 66CN, 90NC y 90CN (Fig. 2d, e). Los resultados anteriores demuestran que la mejor ruta de inmunización, adyuvante e inmunógeno fue una inyección subcutánea, el adyuvante Montanide ISA 61 VG y la proteína de fusión 66NC, respectivamente, que indujeron una fuerte respuesta de IFN-γ específica de antígeno en ratones C57BL/6.

un diagrama esquemático de la línea de tiempo de vacunación. b, c Se utilizó el ensayo IFN-γ ELISpot para determinar la expresión de IFN-γ específica de antígeno en linfocitos esplénicos de ratones inmunizados por vía intramuscular (IM) y subcutánea (SC) con la proteína de fusión 66NC formulada en diferentes adyuvantes Montanide ISA 206 VG (206 VG ), Montanide ISA 61 VG (61 VG), y Montanide GEL 02 PR (GEL) y estimulados con el antígeno indicado, con el adyuvante solo como control negativo. b Imágenes representativas del ensayo IFN-γ ELISpot (experimento representativo con al menos tres réplicas independientes). c Cuantificación del ensayo IFN-γ ELISpot. d, e El ensayo IFN-γ ELISpot se utilizó para determinar la expresión de IFN-γ específica de antígeno en linfocitos esplénicos de ratones inmunizados por vía subcutánea (SC) con proteína de fusión (66NC, 66NC, 90NC y 90CN) formulada en adyuvante Montanide ISA 61 VG y estimulados con el antígeno indicado, con el adyuvante solo como control negativo. d Imágenes del ensayo IFN-γ ELISpot (representativas de un experimento con al menos tres réplicas independientes). e Cuantificación del ensayo IFN-γ ELISpot. c, e Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Se usó ANOVA unidireccional para analizar la significación estadística, seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. *** P < 0,001.

Los ratones se inmunizaron dos veces, a intervalos de dos semanas, con 50 µg de 66NC mezclados en adyuvante 61VG por vía subcutánea, y se usó poliproteína 74 F como control de vacuna de subunidad. Tres semanas después de la segunda inmunización, se sacrificaron seis ratones de cada grupo y se evaluaron los anticuerpos anti-66NC, la secreción de citoquinas y la respuesta de las células T (Fig. 3a). Con respecto a las respuestas de anticuerpos, los ratones inmunizados con 66NC mostraron respuestas robustas de IgG1 e IgG2a contra la proteína de fusión 66NC y los niveles de anticuerpos de los ratones inmunizados con 66NC fueron significativamente más altos que los de los ratones inmunizados con 74F (Fig. 3b). Los grupos de control con adyuvante solo no mostraron ninguna respuesta específica a 66NC.

un diagrama esquemático de la línea de tiempo de vacunación. A los ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía subcutánea dos veces (con tres semanas de diferencia) 50 µg de proteína de fusión 66NC formulada en adyuvante Montanide ISA 61 VG. Los grupos de control incluyen ratones inmunizados con adyuvante Montanide ISA 61 VG solo como control negativo o adyuvante MPL mixto 74 F como control de vacuna de subunidades. Tres semanas después de la inmunización de refuerzo, se extrajo sangre de los ratones y se sacrificaron. b Los isotipos IgG1 e IgG2a específicos de antígeno se midieron mediante ELISA. c Imágenes del ensayo ELISpot de IFN-γ e IL-4 (representativas de un experimento con al menos cinco réplicas independientes). d, e Cuantificación del ensayo ELISpot de IFN-γ e IL-4. f El porcentaje de linfocitos T específicos de antígeno positivos para citocinas (%Cyt+) se cuantificó mediante tinción de citocinas intracelulares (ICS) en CD4+ y CD8+ después de la estimulación de los linfocitos T esplénicos con el antígeno indicado. g Los niveles de citocinas séricas de IFN-γ, TNF-α e IL-17A se midieron mediante ELISA. Las barras de error d-g indican el error estándar de la media (SEM). Se utilizó ANOVA unidireccional para analizar la significación estadística, seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. **P < 0,01, ***P < 0,001.

Las células Th1 producen citoquinas como IFN-γ, TNF-α e IL-2, siendo IFN-γ la citoquina que caracteriza el linaje30. En comparación con las células Th1, las células Th2 generan IL-4, IL-5 e IL-13, y la IL-4 es la citocina principal que contribuye a la transformación de las células T vírgenes en células Th230. Las respuestas inmunitarias Th1 y Th2 se evaluaron mediante el ensayo ELISpot de IFN-γ e IL-4. La vacunación con 66NC indujo números relativos más altos de linfocitos esplénicos que expresan IFN-γ e IL-4 que la vacunación con 74 F o solo la vacunación adyuvante (Fig. 3c-e).

Posteriormente, evaluamos las reacciones de linfocitos T específicas de antígeno en el bazo a través de análisis ICS. Se observaron respuestas superiores de células T CD4+ T y CD8+ secretoras de IFN-γ-, TNF-α e IL-17A en el bazo de ratones vacunados con 66NC en comparación con ratones vacunados con 74F (Fig. 3f). Además, se determinaron mediante ELISA los niveles de IFN-γ, TNF-α e IL-17A en suero. Los niveles de estas tres citoquinas fueron más altos en los ratones inmunizados con 66NC en comparación con los ratones inmunizados con 74F o que recibieron solo adyuvante (Fig. 3g). Estos datos sugieren que los ratones vacunados con 66NC mostraron respuestas inmunitarias de tipo Th1, Th2 y Th17 y fuertes respuestas de anticuerpos.

En la semana seis, los ratones vacunados se expusieron por vía intraperitoneal a 109 CFU de MAP K-10 y se sacrificaron en las semanas 2, 4, 8 y 12 después del desafío para evaluar la eficacia protectora (Fig. 4a). En la etapa clínica de PTB, los síntomas incluyen diarrea persistente, pérdida de peso y emaciación progresiva31. Durante el período experimental, monitoreamos el peso corporal de los ratones vacunados a las 2, 4, 8 y 12 semanas después del desafío. La ganancia de peso de los ratones vacunados con 66NC fue comparable a la de los ratones en blanco y significativamente mayor que en los ratones vacunados con 74F o con adyuvante solo en la semana 2 después del desafío. Estas diferencias persistieron en las semanas 4, 8 y 12 (Fig. 4b). Se sugiere que la inmunidad humoral podría ser beneficiosa en la lucha contra MAP32. Los niveles de anticuerpos en el suero en las semanas 2 a 18, medidos a intervalos de 2 semanas después de la inmunización, se determinaron mediante ELISA. Los niveles de IgG e IgM de los ratones inmunizados con 66NC fueron más altos que los de los ratones inmunizados con 74 F o adyuvante solo, y el anticuerpo IgM se mantuvo hasta 12 semanas después de la vacunación (Fig. 4c, d). Sorprendentemente, el título de anticuerpos IgG se mantuvo en un nivel alto hasta las 18 semanas (Fig. 4c). La carga bacteriana (UFC) se midió en el hígado y el intestino de los ratones en diferentes momentos después de la exposición. En el hígado, la carga de MAP disminuyó significativamente en los ratones vacunados con 66NC en comparación con los ratones vacunados con 74 F o solo con adyuvante a las 2, 4 y 8 semanas después del desafío (Fig. 4e). Se observaron resultados cualitativamente similares en el hígado de ratones vacunados dos semanas después de la exposición mediante la tinción de Ziehl-Neilsen (Fig. 4g). Los ratones vacunados con 66NC mostraron cargas de MAP significativamente reducidas en el intestino en comparación con los ratones vacunados con 74 F o con adyuvante solo a las 2 y 4 semanas después de la exposición a MAP K-10 (Fig. 4f). No se cultivaron bacterias del hígado a las 12 semanas ni del intestino a las ocho semanas y 12 semanas después de la exposición.

un diagrama esquemático de la línea de tiempo de vacunación y desafío de MAP. A los ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía subcutánea dos veces (con tres semanas de diferencia) 50 µg de proteína de fusión 66NC formulada en adyuvante Montanide ISA 61 VG (61 VG). Los grupos de control incluyen ratones inmunizados con adyuvante Montanide ISA 61 VG solo como control negativo o adyuvante MPL mixto 74 F como control de vacuna de subunidades. Tres semanas después de la inmunización de refuerzo, los ratones fueron expuestos a MAP K-10 mediante inyección intraperitoneal. b Se midió el peso corporal durante 2, 4, 8 y 12 semanas después de la prueba con MAP (n = 6 por grupo). Controle los niveles de anticuerpos IgG (c) e IgM (d). Se recogieron sueros y se midió la respuesta específica de anticuerpos anti-66NC o 74F tanto de IgG como de IgM a las 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 semanas después de la vacunación inicial mediante ELISA. La cuantificación de la carga bacteriana se evaluó en el hígado (e) y el intestino (f) de ratones expuestos a una inyección intraperitoneal con MAP K-10 durante 2, 4 y 8 semanas después de la vacunación. g Se presentan imágenes representativas de la tinción acidorresistente de Ziehl-Neelsen en el hígado de ratones vacunados, dos semanas después de ser desafiados con MAP (barras de escala, 100 μm (arriba) y 10 μm (abajo)). Las imágenes inferiores se amplían a partir de las áreas delineadas de las imágenes superiores. b, e, f Los datos indican resultados acumulativos de al menos tres a seis repeticiones independientes. Se usaron la media ± SEM y ANOVA de dos vías para analizar la significancia estadística, seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. ns, no significativo; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

La macropatología y la histopatología se realizaron en muestras de hígado e intestinos obtenidas después de la necropsia de ratones 2 semanas después de la exposición. Se observaron numerosos granulomas en la superficie del hígado en ratones inmunizados solo con 74 F y adyuvante. Por el contrario, los granulomas eran menos y más pequeños en ratones inmunizados con 66NC (Fig. 5a, b, flecha negra). Además, se observaron macrogranulomas visibles en el intestino en ratones inmunizados solo con 74 F y adyuvante, mientras que los ratones vacunados con 66NC no tenían patología visible (Fig. 5c, d, flecha negra). Con respecto a la histopatología, las muestras de hígado de ratones que recibieron adyuvante solo mostraron múltiples microgranulomas (flecha negra) y grandes áreas focales visibles de necrosis dieron como resultado la formación de macrogranulomas (flecha verde).

Para evaluar la macropatología, se fotografiaron el hígado y el intestino de los ratones expuestos a una inyección intraperitoneal con MAP K-10 durante dos semanas después de la vacunación. Una imagen representa un experimento con al menos cinco réplicas independientes. a Cambios macropatológicos en el hígado. Montanide ISA 61 VG (61 VG): numerosos macrogranulomas (flecha negra), 66NC: pocos microgranulomas (flecha negra), 74 F: numerosos macrogranulomas (flecha negra). b Puntuación de macropatología hepática. c Cambios macropatológicos en el intestino. Montanide ISA 61 VG (61 VG): macrogranulomas (flecha negra), 66NC: sin patología visible, 74 F: macrogranulomas (flecha negra). d Puntaje de macropatología intestinal. b, d media ± SEM y ANOVA unidireccional se utilizaron para analizar la significancia estadística, seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. ns, no significativo; *P < 0,05; *** P < 0,001.

Por el contrario, el hígado de los ratones vacunados con 66NC solo tenía múltiples microgranulomas (flecha negra; Fig. 6a, b). Además, se observaron macrogranulomas visibles de la serosa (flecha verde) y múltiples microgranulomas en el parénquima (flecha negra) en los ratones vacunados con 74 F. Asimismo, los intestinos de los ratones vacunados con sólo adyuvante o 74 F tenían un macrogranuloma en la superficie serosa (flecha verde). Además, muchos infiltrados de células inflamatorias en la capa muscular o la lámina propia (flecha azul). Por el contrario, el intestino de los ratones vacunados con 66NC no presentaba patologías (Fig. 6c, d). Los resultados anteriores sugieren que la proteína de fusión 66NC formulada en adyuvante Montanide ISA 61 VG contribuyó a mejorar la protección de los ratones C57BL/6 contra MAP K-10 y es mejor que la proteína de fusión 74F mezclada en adyuvante MPL.

Se evaluó la histopatología en las secciones de hígado e intestino teñidas con hematoxilina y eosina de ratones expuestos a inyección intraperitoneal con MAP K-10 durante 2 semanas después de la vacunación. Una imagen representa un experimento con al menos cinco réplicas independientes. a Cambios histopatológicos en el hígado (barras de escala, 200 μm (arriba) y 50 μm (abajo)). Montanide ISA 61 VG (61 VG): macrogranulomas (flecha verde) y microgranulomas múltiples (flecha negra), 66NC: microgranulomas múltiples (flecha negra), 74 F: macrogranulomas (flecha verde) y microgranulomas múltiples (flecha negra) . Las imágenes inferiores se amplían a partir de las áreas delineadas de las imágenes superiores. b Puntuación de histopatología hepática. c Cambios histopatológicos en el intestino (barras de escala, 200 μm (arriba) y 50 μm (abajo)). Montanide ISA 61 VG (61 VG): macrogranulomas (flecha verde) e infiltración de células inflamatorias (flecha azul), 66NC: sin patologías, 74 F: macrogranulomas (flecha verde) e infiltración de células inflamatorias (flecha azul). Las imágenes inferiores se amplían a partir de las áreas delineadas de las imágenes superiores. d Puntuación de histopatología intestinal. b, d Media ± SEM y ANOVA unidireccional se utilizaron para analizar la significación estadística seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. ns, no significativo; *P < 0,05; ** P < 0,01.

Para investigar la correlación entre los niveles de citocinas y la carga bacteriana (UFC) en ratones después de la inmunización, evaluamos los linfocitos T CD4+ o CD8+ secretores de citocinas específicos de antígeno (Cyt+) del bazo y el nivel de citocinas séricas de ratones vacunados en dos semanas después de los desafíos MAP K-10. La inmunización con 66NC dio como resultado una mayor respuesta de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno secretoras de IFN-γ-, TNF-α- e IL-17A en el bazo que la vacunación con 74F o con adyuvante solo después de la exposición (Fig. 7a), y se observaron resultados consistentes para el nivel de IFN-γ y TNF-α en suero de ratones inmunizados contra MAP K-10; sin embargo, desafortunadamente, no se detectó IL-17A en suero (Fig. 7c). Entre IFN-γ- (P = 0,00033 o P = 0,029), TNF-α- (P = 0,0039 o P = 0,005), IL-17A- (P = 0,02 o P = 0,13) e IFN-γ + TNF- α + IL-17A-(P = 0,00042 o P = 0,0075) que secretan células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno en el bazo se correlacionaron con una disminución de la carga bacteriana en el hígado (Fig. 7b) y el nivel de IFN-γ (P = 0,012), TNF-α (P = 0,00071) e IFN-γ + TNF-α (P = 0,0047) en suero también se correlacionaron con una carga bacteriana reducida en el hígado (Fig. 7d). También se observaron resultados consistentes en el intestino (Fig. 1 complementaria), lo que sugiere la importancia de IFN-γ, TNF-α e IL-17A para la protección contra MAP.

a Porcentaje de linfocitos T CD4+ y CD8+ esplénicos positivos para citocinas (Cyt+) medido mediante tinción de citocinas intracelulares dos semanas después de la exposición a MAP de ratones vacunados con el antígeno indicado. b Correlación de Pearson (R) de linfocitos T Cyt+ CD4+ y CD8+ con CFU en el hígado después de la exposición. c Se evaluaron los niveles de citocinas en suero de ratones vacunados y con adyuvante Montanide ISA 61 VG (61 VG) (66NC y 74 F) 2 semanas después de la exposición a MAP K-10. d Correlaciones de Pearson de los niveles de citocinas con CFU en el hígado después de la exposición a IFN-γ y TNF-α. Datos representativos de un experimento con al menos cinco réplicas independientes, media ± SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional para analizar la significación estadística, seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. ns, no significativo; *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001.

El desarrollo de vacunas de subunidades de proteínas recombinantes compuestas por composiciones claramente definidas producidas por sistemas de expresión heterogéneos ha recibido una atención creciente en los últimos años33,34. Una vacuna de subunidades no puede replicarse en el cuerpo y, por lo tanto, se considera más segura35. Desde una perspectiva de compatibilidad, una vacuna de subunidades ideal no interferiría con el diagnóstico de la enfermedad mediante las pruebas actuales. Se ha encontrado que varias proteínas MAP inducen diferentes niveles de protección contra la infección en animales de experimentación19,36,37. Los informes sugieren que una mezcla de antígenos recombinantes es mejor para el desarrollo de vacunas. Sin embargo, el costo de preparar y usar una vacuna de este tipo para bovinos u ovinos puede ser demasiado alto. Para abordar este problema, las proteínas de fusión se están construyendo y probando en un modelo de ratón para determinar su capacidad para proporcionar protección inmunitaria contra MAP. Se ha descubierto que una proteína de fusión, 74 F de MAP, con monofosforil lípido A (MPL) y bromuro de dimetiloctadecilamonio (DDA) protege a ratones y cabras, respectivamente21,24. Inspirados por el éxito de esta proteína de fusión, construimos cuatro proteínas de fusión utilizando los genes map3527, ag85b y hsp 70 de MAP (Fig. 1a). Los costos de las vacunas veterinarias son un tema esencial, y el uso de inmunoestimulantes costosos, como DDA y MPL, para la producción a gran escala de vacunas para animales sería prohibitivo. En este estudio, propusimos usar adyuvante de aceite mineral (Montanide ISA 61VG y Montanide ISA 206 VG) y adyuvante a base de agua (Montanide GEL 02 PR) como adyuvantes en vacunas de subunidades, ya que pueden inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares específicas, y son ampliamente utilizado en la investigación de vacunas en bovinos, ovinos y ratones38,39,40,41. Aunque no son absorbibles y son fuertemente irritantes, que son desventajas, los adyuvantes a base de aceite pueden proteger el antígeno de la rápida degradación por enzimas y la emulsión aumenta la persistencia del antígeno para inducir respuestas inmunitarias sostenidas38.

El IFN-γ es una de las principales citocinas que se activa cuando el ganado se infecta con MAP42, y los estudios han demostrado que una mayor expresión de IFN-γ en corderos inmunizados con vacunas de ADN puede protegerlos de la infección por MAP37. En el presente estudio, inmunizamos ratones con las cuatro proteínas de fusión (66NC, 66CN, 90NC y 90CN) en combinación con diferentes adyuvantes. Mediante la utilización de una pantalla ELISpot de IFN-γ, identificamos la combinación más efectiva de inmunógeno (66NC) y adyuvante Montanide ISA 61VG. Observamos que los ratones vacunados con la proteína de fusión 66NC formulada con adyuvante 61VG tenían una respuesta de IFN-γ específica de antígeno significativamente mayor que los inmunizados con adyuvante solo o proteína de fusión 74F. Se cree que las respuestas inmunitarias mediadas por células son las más exitosas para eliminar los patógenos intracelulares, incluidas las micobacterias, y brindar protección43. Sin embargo, la investigación ha indicado que una vacuna que comprende múltiples componentes, que induce respuestas inmunitarias mediadas por células T y B, es más eficaz para proteger contra Mycobacterium tuberculosis (MTB) H37Rv que una vacuna de subunidades que solo estimula la inmunidad de las células T44. El estudio actual reveló que los ratones inmunizados con la proteína de fusión 66NC tenían una respuesta de IL-4 específica de antígeno más pronunciada y una respuesta de anticuerpos más fuerte que los inmunizados con adyuvante solo o 74 F. Además, los anticuerpos durante la infección tuberculosa latente promovieron la maduración fagolisosomal y Activación del inflamasoma, lo que facilita la eliminación de MTB45 intracelular por parte de los macrófagos. Además, una fuerte respuesta inicial de IgG1 después de la vacunación de las ovejas fue crucial para prevenir la infección por MAP32. Aunque una respuesta Th1 generada después de la vacunación con BCG no siempre indica protección46, la IL-4, una citoquina Th2, se ha relacionado con la defensa contra las micobacterias47. En general, se ha observado que la proteína de fusión 66NC provoca respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales específicas de antígeno, lo que podría ser un factor significativo en la protección contra MAP.

En las etapas iniciales de la infección por MAP, los linfocitos CD4+ estimulan el IFN-γ, activan los macrófagos de manera clásica (M1), liberan citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6 y potencian la actividad microbicida48, 49,50. Durante la infección por MAP, las células T citotóxicas CD8+ desempeñan un papel crucial en la eliminación de MAP1 intracelular. Encontramos que las respuestas de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno que secretan IFN-γ y TNF-α se asociaron con protección en ratones C57BL/6 después de ser inmunizados y desafiados durante dos semanas. Además, se observaron resultados similares en el nivel de IFN-γ y TNF-α en el suero de ratones inmunizados contra MAP. También observamos que las respuestas de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno secretoras de IL-17A después de la vacunación se correlacionaron con la inmunoprotección en ratones C57BL/6 dos semanas después de la exposición. La evidencia sugiere que la secreción de IL-17, que puede atribuirse en parte a las células gamma-delta T (γδT) y las células linfoides innatas del grupo 3 (ILC3), puede mejorar la capacidad fagocítica y la presentación de antígenos51,52. Después de la vacunación con una vacuna atenuada de MTB ΔLprG, el aumento de los niveles de IL-17A en el suero se asoció con una disminución de la carga bacteriana en los pulmones después de la exposición a MTB53. El análisis de la vacuna inactivada Silirum reveló que no había una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de transcripción de IL-17A entre cabras vacunadas y no vacunadas por macrófagos derivados de monocitos54. Nuestro estudio reveló que el suero de ratones inmunizados con 66NC tenía un nivel significativamente mayor de IL-17A en comparación con los grupos no inmunizados e inmunizados con 74 F. A pesar de la incapacidad de detectar IL-17A en el suero dos semanas después de la exposición, todavía se pudieron observar respuestas de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno que secretan IL-17A. La principal explicación de esto es que se observó una reducción de IL-17 en las PBMC de cabras infectadas con MAP28 y ganado con una infección subclínica de MAP55. Además, la secreción de citocina IL-17A puede disminuir en ratones inmunizados contra la infección por MAP, pero la sensibilidad a la concentración del ensayo ELISA es limitada.

En ausencia de síntomas clínicos, el estándar de oro para evaluar los efectos protectores de las vacunas MAP es la patología y la carga bacteriana de los tejidos56,57. Por lo tanto, para evaluar la eficacia protectora de 66NC, elegimos el hígado y el intestino como los órganos de evaluación, ya que se encontró que estos eran indicadores confiables del estado infeccioso de los ratones después del desafío con MAP en estudios previos26,58. Dos semanas después del desafío, se observó una reducción en el número de UFC tanto en el hígado como en el intestino, lo que implica la eliminación de MAP. Además, la proteína de fusión 66NC redujo con éxito el daño patológico y la cantidad de bacterias acidorresistentes en los hígados de los animales vacunados. Los rumiantes que padecen PTB experimentan diarrea y una reducción drástica del peso corporal59,60. Medimos el peso corporal de los ratones vacunados con 66NC después del desafío. El peso corporal de los ratones inmunizados con 66NC permaneció comparable al de los ratones en blanco, en contraste con el peso corporal de los ratones inmunizados con 74 F y el grupo adyuvante, que disminuyó en diferentes grados. En conclusión, se demostró que la inmunización con 66NC es significativamente más eficaz para proteger a los ratones contra la infección por MAP que la vacuna 74 F, como lo demuestra la carga de MAP sustancialmente reducida en los órganos, la mejora de la patología hepática e intestinal y el mantenimiento del peso corporal.

En resumen, la vacunación con la proteína de fusión 66NC dio como resultado el control bacteriano, alivió el daño patológico en el hígado y el intestino y redujo la pérdida de peso corporal después de la exposición a MAP K-10 en C57BL/6. Se observó una correlación entre la protección y la secreción de IFN-γ, TNF-α e IL-17A por parte de los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de antígeno en el bazo de los ratones después del desafío. Además, los niveles séricos de IFN-γ y TNF-α después de la inmunización se relacionaron con la eficacia protectora. Además, los ratones inmunizados con 66NC demuestran un mayor efecto protector contra MAP K-10 que los inmunizados con 74 F. Las distintas características de los antígenos en la vacuna de proteína de fusión hacen que sea poco probable que interfiera con la prueba cutánea de tuberculosis bovina en bovinos u ovinos. Se requiere investigación adicional en especies como el ganado vacuno o el ovino para determinar si la vacuna de la subunidad 66NC de la proteína de fusión puede proteger contra la PTB sin provocar reacciones a la prueba cutánea de la tuberculosis bovina.

Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis K-10 se cultivó en medio Middlebrook 7H9 (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.) o medio Middlebrook 7H10 (BD Biosciences) suplementado con Tween 80 al 0,05 % (Amresco, Solon, OH, EE. glicerol (Sigma-Aldrich, Shanghai, China), 10 % de ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC, BD Biosciences) y 2 mg/L de micobactina J (Allied Monitor, Fayette, MO, EE. UU.) a 37 °C. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de seis semanas de Liaoning Changsheng Biotechnology Co. Ltd (Liaoning, China). Todos los experimentos con animales se diseñaron para minimizar el número de animales utilizados, y se hicieron esfuerzos para minimizar tanto la angustia como el dolor. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Instituto de Investigación Veterinaria de Harbin, China (Número de aprobación del Comité de Ética HVRI-IACUC-200723-01).

66NC se generó mediante la conexión continua en tándem con los marcos de lectura abiertos (ORF) de la porción N-terminal de ~18,9 kDa de MAP3527 (residuos 40–232, 193 aa) a ~30,8 kDa de Ag85B sin el péptido señal (residuos 41–330, 290 aa, con el codón de parada omitido), seguido en el extremo C con el fragmento C-terminal de ~13,0 kDa (residuos 231–361, 131 aa, con el codón de parada omitido) de MAP3527. Además, 66NC comprende un solo ORF organizado en el orden lineal MAP3527N40–232-Ag85B41-330–MAP3527C231–361; 66CN fue generado por los ORF en tándem de MAP3527C231–361 a Ag85B seguido de MAP3527N40–232, desde MA3527C231–361- Ag85B41–330-MAP3527N40–232 ORF.

90NC, que incluye el ORF completo de Hsp70 (sin codón de terminación) en lugar de Ag85b, está codificado por el ORF MA3527N40–232-Hsp70-MAP3527C231–361. Asimismo, 90CN incluye Hsp70 en lugar de Ag85b, pero está codificado por MA3527C231–361-Hsp70-MAP3527N40–232 ORF.

Los genes map3527N40–232 y map3527C231–361 se amplificaron a partir del genoma de MAP K-10 usando PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa Bio, Beijing, China) y los cebadores MAP3527N-F/R y MAP3527C-F/R, respectivamente (Suplementario Tabla 1). El procedimiento de reacción de PCR es el siguiente para hacerlo. Predegeneración a 98 °C por 5 min, degeneración a 98 °C por 10 s, recocido a 65 °C por 15 s, extensión a 72 °C por 10 s, con 30 ciclos, luego extensión final a 72 °C por 1 minuto. Los productos de PCR se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR (TIANGEN, Beijing, China). Luego se ligaron por separado en el vector pET28a (Novagen, Darmstadt, HE, Alemania), que había sido doblemente digerido por Nde I y EcoR I, utilizando el kit de clonación Trelief SoSoo (TSINGKE, Beijing, China) a 50 °C para 15 minutos. Los productos ligados luego se transformaron en Escherichia coli (E. coli) DH5α y las colonias con los plásmidos correctos, que se denominaron pET28a-MAP3527N y pET28a-MAP3527C, se determinaron mediante PCR y secuenciación de ADN. Luego, los genes map3527N40–232 y map3527C231–361 se amplificaron nuevamente utilizando los cebadores MAP3527NN-F/R y MAP3527CC-F/R, respectivamente (Tabla complementaria 1) y se ligaron en pET28a-MAP3527C y pET28a-MAP3527N, que se habían duplicado. digerido por Hind III y Xho I, utilizando el kit de clonación Trelief SoSoo. Finalmente, los productos ligados fueron identificados por PCR y verificados por secuenciación de ADN y fueron denominados pET28a-MAP3527N-MAP3527C y pET28a-MAP3527C-MAP3527N.

Los genes ag85b (sin secuencia de péptido señal de 1 a 40 aa) y hsp70 se amplificaron utilizando el genoma MAP K-10 como plantilla con Ag85BNC-F/R, Ag85BCN-F/R, Hsp70NC-F/R y Hsp70CN-F /R y se subclonaron en construcciones pET28a-MAP3527N-MAP3527C y pET28a-MAP3527C-MAP3527N, que se sometieron a digestión doble con EcoR I y Hind III, utilizando el kit de clonación Trelief SoSoo. Después de la unión, los productos se transformaron en E. coli DH5α y los transformantes que contenían el inserto y la orientación correctos se verificaron mediante PCR y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las construcciones finales, que codifican proteínas de fusión de 66 kDa (66NC y 66CN) y 90 kDa (90NC y 90CN), comprenden un solo ORF organizado en los siguientes órdenes lineales: MAP3527N-Ag85B-MAP3527C, MA3527C-Ag85B-MAP3527N, MA3527N-Hsp70- MAP3527C y MA3527C-Hsp70-MAP3527N.

El plásmido recombinante se expresó en la cepa BL21 de E. coli (DE3) en medio LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina. Se añadió un cultivo desarrollado durante la noche de BL21 que contenía plásmido recombinante a 1 L de medio LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina y se cultivó a 37 °C con agitación. Los cultivos se indujeron a una DO600 nm de 0,6 a 0,8 con isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) 1 mM durante 4 h a 37 °C, 350 × g. Las células bacterianas inducidas se recogieron y sonicaron con tampón A (Tris-HCl 20 mM-NaCl 150 mM-glicerol al 10 %-pH 8,0) y se centrifugaron a 33.264 × g durante 10 min. Los sedimentos se disolvieron en tampón A que contenía lauroilsarcosina sódica al 0,5 % y luego se dializaron durante 24 h frente a tampón A que contenía glutatión oxidado 0,1 mM y glutatión reducido 0,9 mM. A continuación, la proteína que se sometió a diálisis se centrifugó a una velocidad de 33 264 × g durante 30 min y el sobrenadante se cargó en resina Ni-NAT (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suecia). Cada proteína diana se eluyó con tampón de elución (Tris-HCl 20 mM-NaCl 150 mM-glicerol al 5%-imidazol 500 mM-pH 8,0). Cada proteína purificada se sometió a un kit de eliminación de endotoxina ToxinEraser (Genscript, Nanjing, China) para eliminar la endotoxina y se confirmó mediante análisis de espectrometría de masas.

El procedimiento de construcción del 74 F fue mencionado en los informes anteriores21. A continuación se incluyen breves descripciones. El producto del gen MAP3527C183–361 correcto se ligó en el vector pET17b, seguido de la ligadura del producto MAP1519N1–460 en el pET17b-MAP3527C183–361. Finalmente, el producto MAP3527N33–180 se ligó al pET17b-MAP3527C183–361-MAP1519N1–460. El plásmido recombinante (pET17b-MAP3527C183–361-MAP1519N1–460-MAP3527N33–180) se analizó por secuenciación y se transformó en E. coli BL21 en medio LB con 100 μg/mL de ampicilina. La expresión y purificación de 74 F se realizaron según los métodos descritos anteriormente. La confirmación de la proteína 74 F purificada se logró mediante el uso de análisis de espectrometría de masas.

Treinta y seis ratones fueron inmunizados (en grupos de tres) con 50 μg de la proteína de fusión 66NC mezclada con Montanide ISA 61 VG (agua en aceite, Seppic, París, Francia), Montanide ISA 206 VG (agua en aceite -en agua, Seppic), o Montanide GEL 02 PR (adyuvante a base de agua, Seppic) en una proporción de volumen de solución de proteína o PBS: adyuvante de 1:1,5, respectivamente. El mismo volumen de PBS se mezcló por separado con los tres adyuvantes anteriores como control negativo. Los seis grupos mencionados anteriormente fueron vacunados utilizando dos vías de inmunización. Cada grupo se administró dos veces, con tres semanas de diferencia, en un volumen total de 100 μL. Se inyectaron dieciocho ratones por vía intramuscular (IM) en el muslo, y otros dieciocho ratones se inyectaron por vía subcutánea (SC) en la espalda (Tabla complementaria 2). Se inmunizaron quince ratones (en grupos de tres) con un volumen total de 100 μL con adyuvante Montanide ISA 61 VG más 50 μg de proteína de fusión 66NC, 66CN, 90NC o 90CN o PBS mediante inyección SC en una solución de proteína o PBS: adyuvante relación de volumen de 1:1,5, respectivamente.

Todos los animales de cada grupo fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 tres semanas después de la segunda inmunización, y los linfocitos se aislaron del bazo usando el Mouse Spleen Lymphocyte Separation Medium Kit (TBD Science, Tianjin, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para IFN-γ ELISpot ensayo. Los detalles del procedimiento son los siguientes. El bazo de ratón se separó asépticamente con tijeras, se cortó en trozos pequeños y se molió en el líquido de enjuague homogeneizado (TBD Science). La suspensión unicelular se obtuvo a través de un tamiz de malla 70, luego se centrifugó a 350 × g durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Todas las células de tejido se resuspendieron en diluyente de muestra de tejido (TBD Science) y luego se añadieron a la superficie del medio de separación de linfocitos (TBD Science). Los linfocitos de bazo se obtuvieron por centrifugación a 400 × g durante 30 min y luego se lavaron con una solución de lavado (TBD Science) y se purificaron eliminando las células adheridas.

Noventa y seis ratones se separaron aleatoriamente en cuatro grupos y se inmunizaron por vía subcutánea dos veces con un intervalo de tres semanas. El grupo I (seis ratones) no se sometió a ningún tratamiento, sirviendo como control en blanco para el control del peso corporal. El grupo II (30 ratones) sirvió como el grupo de ratones no vacunados a los que se les administró el adyuvante Montanide ISA 61 VG solo. El grupo III (30 ratones) estaba compuesto por ratones inmunizados dos veces con 50 µg/ratón de proteína de fusión 66NC mezclada con adyuvante Montanide ISA 61 VG. Grupo IV (30 ratones) inmunizados con 50 μg/ratón de 74 F y combinados con adyuvante MPL (Sigma Adjuvant System, Shanghái, China) en una proporción de proteína:volumen de adyuvante de 1:1 y se utilizó como control de vacuna de subunidad21. Se recolectaron esplenocitos y muestras de suero de seis ratones en los grupos II, III y IV tres semanas después de la inmunización secundaria para análisis mediante ELISpot, ELISA y tinción de citoquinas intracelulares para evaluar la inmunogenicidad como se describe a continuación.

Los ratones restantes de cada grupo (n = 24) se expusieron a 109 unidades formadoras de colonias (CFU)/ratón de MAP K-10 mediante inyección intraperitoneal. Seis ratones por grupo fueron sacrificados por inhalación de CO2 a las 2, 4, 8 y 12 semanas después del desafío, y los hígados e intestinos se recolectaron con tijeras estériles, se observaron y fotografiaron para el examen patológico y se dividieron en dos partes. Una parte se utilizó para el recuento de colonias, mientras que la otra se perfundió con formaldehído al 10 % para el análisis histopatológico. Además, se recogieron esplenocitos y muestras de suero de seis ratones por grupo dos semanas después de la exposición para analizar las citoquinas intracelulares y secretadas, respectivamente.

Las respuestas inmunitarias específicas de antígeno a 66NC o 74F se evaluaron mediante ensayos ELISpot de IFN-γ e IL-4 según Liu J et al. con modificaciones menores61. Los detalles de los métodos son los siguientes. Se añadieron linfocitos esplénicos aislados (5 × 105 células por pocillo) a placas de 96 pocillos recubiertas previamente con anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ o IL-4 y se estimularon a 37 °C durante 48 h con 10 μg/ml de fusión 66NC o 74 F proteína. Se añadió el mismo volumen de PBS que el control negativo. Los números de esplenocitos secretores de IFN-γ e IL-4 se midieron usando el kit ELISpot de IFN-γ o IL-4 de ratón (Dakewe, Beijing, China), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas se secaron al aire y las manchas se contaron usando un iSpot Reader Spectrum (AID, Strassberg, Alemania).

Los niveles de IgG, IgM, IgG1 e IgG2a específicos de antígeno se determinaron mediante un ELISA sándwich tradicional. Las placas ELISA de 96 pocillos Costar (Corning, NY, EE. UU.) se recubrieron con 66NC o 74 F (500 ng/pocillo) en un tampón de hidrogenocarbonato de sodio (CBS, pH 8,5) a 4 °C durante la noche. Luego, para evitar la unión inespecífica a proteínas, se añadió leche descremada al 5 % a PBST (Tween-20 al 0,05 % en PBS, pH 7,4) durante 2 h a 37 °C. Después de tres lavados con PBST, se agregaron diluciones en serie de muestras de suero (se recogió sangre de la vena de la cola de los ratones y se centrifugó a 1000 × g durante 5 min) a las placas ELISA recubiertas de antígeno, que se incubaron a 37 °C durante 1 H. Después del lavado, IgG (ab6728)/IgM (ab97230)/IgG1 (ab97240)/IgG2a (ab97245) conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de conejo o cabra anti-ratón (dilución 1:10,000 en PBST, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) se utilizaron como anticuerpos secundarios y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Finalmente, las placas se lavaron y se añadió sustrato TMB (Sigma-Aldrich, Shanghái, China) y se incubaron durante 15 min para el desarrollo del color. La lectura se realizó a OD450nm utilizando un lector de microplacas ELx808 (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) después de agregar 2 M H2SO4 como solución de parada. El título de anticuerpos séricos es la dilución más grande en la que la OD450positiva/OD450negativa > 2,1.

Se utilizaron ensayos de tinción de citoquinas intracelulares (ICS) para evaluar las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno y se realizaron como se describió anteriormente con una ligera modificación61. Brevemente, se sembraron 1,5 × 106 esplenocitos en una placa de 6 pocillos y se cultivaron a 37 °C con una concentración final de 10 μg/ml de proteína de fusión 66NC o 74 F. Se añadió el mismo volumen de PBS que el control. Después de 12 h de incubación, se añadieron Golgi-Plug y Golgi-Stop (BD Biosciences). Las células se incubaron durante 4 h. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD4 de ratón conjugado con PE (12-0041-82)/CD8α (MCD0804) (1:50, ThermoFisher, Waltham, MA, EE. UU.) a 4 °C durante 30 min, protegidas de la luz. Después de lavar dos veces con tampón FACS frío, las células se fijaron y permeabilizaron con Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), y luego se lavaron dos veces con tampón Perm Wash. Las células se tiñeron con anti-IFN-γ conjugado con PE/Cy5 (1:50, XMG1.2, ab272255, Abcam), IL-17A anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 647 (1:50, TC11-18H10, 560184 , BD Biosciences), anti-TNF-α de ratón conjugado con eFluor 450 (1:50, MP6-XT22, 48-7321-82, ThermoFisher) a 4 °C durante 30 min, protegido de la luz. Anticuerpo PE/Cy5 Rat IgG1 (1:50, RG1, NBP1-43076, Novus Biologicals, Littleton, Co, EE. UU.), Alexa Fluor 647 Rat IgG1 (1:50, KLH/G1-2-2, 0116-31, SouthernBiotech , Birmingham, AL, EE. UU.) y eFluor 450 Rat IgG1 (1:50, eBRG1, 48-4301-82, ThermoFisher) según las instrucciones del fabricante para el control de isotipos. Las células se lavaron dos veces con tampón Perm Wash, se resuspendieron en PBS, se detectaron usando una citometría de flujo Apogee A50-Micro Nanoscale (Apogee Flow Systems, Londres, Reino Unido) y se analizaron con el software Apogee Histogram.

Se recogieron muestras de suero tres semanas después de la inmunización secundaria y dos semanas después de la exposición y se compararon con ratones no vacunados. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las citocinas séricas se determinaron mediante el kit ELISA de ratón IFN-γ/TNF-α/IL-17A (ThermoFisher). Además, se realizaron análisis de regresión múltiple de los niveles de citocinas séricas e intracelulares con UFC en el hígado y el intestino utilizando los paquetes R ggplot2 y ggpubr.

Se recolectaron hígados e intestinos de ratones expuestos a MAP en condiciones asépticas 2, 4, 8 y 12 semanas después de la exposición a MAP y se lavaron con PBS. Los hígados e intestinos fueron fotografiados con una cámara digital (Canon, Tokio, Japón) para análisis de macropatología. Se usó la mitad del hígado y el intestino para enumerar MAP CFU. Se homogeneizaron con una solución PBST estéril, seguido de diluciones en serie en placas 7H10 que contenían 2 mg/l de micobactina J y se incubaron a 37 °C durante 3 a 4 semanas. Y la otra mitad del hígado y el intestino se fijaron por perfusión en formalina neutra al 10 %, se deshidrataron, se incluyeron en bloques de parafina y se seccionaron para tinciones acidorresistentes de hematoxilina y eosina (H&E) Ziehl-Neelsen. Las imágenes se lograron con una microscopía Nikon Eclipse E100 (Nikon, Tokio, Japón). Dos patólogos independientes cuantificaron la puntuación de lesiones pulmonares e intestinales de forma doble ciego. Para la puntuación de macropatología, el porcentaje de área de granuloma en la superficie del hígado se calificó de 0 a 4 utilizando la siguiente escala: 0 = normal (sin granuloma), 1 = levemente aumentado (<1%), 2 = moderadamente aumentado (≥1% y <3%), 3 = muy aumentado (≥3%), 4 = muy aumentado (>3%) con granulomas prominentes. El número de granulomas en la superficie del intestino se calificó de 0 a 3 utilizando la siguiente escala: 0 = sin granuloma, 1 = un granuloma, 2 = dos granulomas y 3 = tres granulomas. Para la puntuación histopatológica, la gravedad de las lesiones hepáticas se puntuó de 0 a 4 utilizando la siguiente escala: 0 = normal, 1 = microgranulomas múltiples, 2 = microgranulomas múltiples con necrosis focal, 3 = macrogranulomas, 4 = macrogranulomas -granulomas con necrosis masiva. La gravedad de las lesiones intestinales se puntuó de 0 a 3 utilizando la siguiente escala: 0 = normal, 1 = múltiples microgranulomas, 2 = macrogranulomas, 3 = macrogranulomas e infiltración de células inflamatorias.

Se utilizó ANOVA unidireccional y bidireccional para analizar la significación estadística, seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 9.0.0. El valor AP < 0,05 fue estadísticamente significativo (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos asociados con este estudio están presentes en el documento o en la Información complementaria. Los recursos, los datos y los reactivos del estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFD1800403) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32002256, 32273005). El análisis de la literatura se realiza utilizando el software Stork (https://www.storkapp.me). El ratón negro fue dibujado por Figdraw en las figuras (www.figdraw.com). Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Guanghui Dang, Siguo Liu.

Laboratorio Estatal Clave para el Control y la Prevención de Enfermedades Animales, División de Enfermedades Bacterianas, Instituto de Investigación Veterinaria de Harbin, Academia China de Ciencias Agrícolas, 678 Haping Street, Harbin, 150069, PR China

Mingzhu Shao, Ning Cui, Yangyang Tang, Fanruo Chen, Yingying Cui, Guanghui Dang y Siguo Liu

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GD y SL conceptualizaron y diseñaron el estudio, y escribieron el artículo. MS realizó los experimentos. NC, YT, FC y YC participaron en inmunizaciones e infecciones de animales. Todos los autores han examinado y validado el contenido del manuscrito.

Correspondencia a Guanghui Dang o Siguo Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Shao, M., Cui, N., Tang, Y. et al. Una vacuna de subunidad candidata induce inmunidad protectora contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en ratones. Vacunas npj 8, 72 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

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Recibido: 07 febrero 2023

Aceptado: 10 de mayo de 2023

Publicado: 20 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

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Una vacuna de subunidad candidata induce inmunidad protectora contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en ratones